氫醌對L-02肝細胞自噬的影響

鄭作兵，張 偉，熊 亮，劉婷婷，吳楊娜，楊嘉輝，胡恭華,

氫醌(hydroquinone，HQ)是一種常見的環境化學物質，廣泛應用于工業和醫療等領域，人類可通過飲食、職業和環境的暴露接觸到HQ。HQ可經消化道、呼吸道、皮膚等途徑進入人體，主要在肝腎代謝，可對肝、腎、造血系統等造成損害。自噬是維持機體內環境穩態的自身消化代謝過程，可以將胞質中的細胞器、蛋白和大分子等物質分解后再利用[1]。已有研究闡明了HQ對人正常L-02肝細胞的細胞周期、增殖、凋亡的影響，并發現其對L-02細胞的DNA損傷作用[2]，而HQ對L-02細胞自噬的影響尚未見報道。為此，該研究以L-02細胞為研究對象，HQ為受試物，觀察不同劑量HQ對人正常肝L-02細胞自噬的影響，為擴展HQ介導的毒理學特征及深入研究自噬在HQ致肝細胞損傷中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與受試物人正常肝細胞(L-02細胞)由深圳市疾病預防控制中心惠贈。HQ購自美國Sigma公司，色譜純，純度≥99.0%。

1.2 儀器與試劑倒置熒光顯微鏡(德國Laica公司)，CO2恒溫培養箱和多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，AI600超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)， Zeiss LSM 880共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)，透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，電泳儀、垂直電泳槽和電轉槽(美國Bio-rad公司)，胎牛血清、RPMI-1640培養基和胰蛋白酶(美國Gibco公司)；雙抗(青霉素、鏈霉素混合液)(美國Sigma公司)；LC3A/B抗體、LC3B抗體、Beclin-1抗體、P62抗體、GAPDH抗體、抗兔二抗和抗鼠二抗(美國Abcam公司)；AdPlus-mCherry-GFP-LC3B(上海碧云天生物技術有限公司)；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TGX FastCast Kit 12%(美國Bio-Rad公司)；PVDF膜、ECL化學發光液(美國Millipore公司)；電鏡固定液、丙酮、無水乙醇、牛血清白蛋白[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 方法

1.3.1細胞培養與分組 L-02細胞用含體積分數為10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中培養，2 ～ 3 d換新培養基。90%融合度后用胰酶消化，取對數生長期的細胞進行實驗。根據課題組前期實驗獲得的DNA損傷、細胞活力、細胞凋亡和細胞周期的檢測結果[2]，實驗分組設置HQ濃度分別為0(陰性對照組)、10、20、40和80 μmol/L，共5個實驗組，處理時間為24 h。

1.3.2透射電鏡檢測自噬體形成 用胰酶消化收集細胞，移至1.5 ml離心管中，加1 ml PBS離心2次，棄上清液，加入電鏡固定液，室溫固定細胞4 h。PBS洗滌2次，用4 ℃預冷的體積分數為0.01鋨酸固定2 h，PBS洗滌3次，體積分數為0.5、0.7、0.8、0.9、1.0的乙醇和體積分數為1.0的丙酮梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋，切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，使用透射電鏡觀察拍照。

1.3.3mCherry-GFP-LC3B融合蛋白來示蹤自噬形成 根據說明書，通過查閱文獻[3]及預實驗確定腺病毒最佳感染濃度及時間，確定腺病毒感染濃度為40感染復數(multiplicity of infection，MOI)，感染時間為24 h。在24孔板中接種5×104個細胞，24 h后每孔加入50 μl的AdPlus-mCherry-GFP-LC3B試劑，轉染24 h。腺病毒成功轉染后，用不同劑量HQ處理細胞，至處理時間終點，用Laica倒置熒光顯微鏡觀察拍照[4]。用Image J軟件計數熒光顆粒數，每個處理組至少隨機計數10個轉染成功的細胞。

1.3.4Western blot檢測LC3、Beclin-1、P62表達 細胞處理時間終點時，用含1 mmol/L PMSF 和1 mmol/L蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備12%分離膠和5%濃縮膠。以每泳道15 μg總蛋白上樣，隨后凝膠電泳，并轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉將膜封閉1 h，加入LC3A/B (1 ∶500)、Beclin-1(1 ∶1 000)、P62 (1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 000)一抗，在4 ℃下孵育過夜。至第2天，室溫下用二抗(1 ∶10 000)孵育1 h，隨后進行化學發光拍照。分析條帶光密度值，利用目的蛋白的光密度值與內參光密度值的比值作為分析結果。

1.3.5免疫熒光檢測LC3、Beclin-1、P62亞細胞定位及表達 在24孔板中接種5×104個細胞做細胞爬片，到處理時間終點，用4%多聚甲醛固定細胞，用含體積分數0.3% Trion X的5% BSA通透及封閉1 h。分別加入LC3B(1 μg/ml)、Beclin-1(1 ∶200)、P62(1 ∶50)一抗在4 ℃下孵育過夜，至第2天，加入抗兔熒光二抗，濕盒中孵育1 h，DAPI復染5 min。在載玻片上滴加抗熒光淬滅劑，取出細胞爬片，有細胞的一面與載玻片接觸，并用指甲油固定爬片。用共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2 結果

2.1 HQ對L-02細胞自噬形成的影響低倍鏡下(×1 500)，對照組細胞中較少觀察到自噬相關結構或細胞器。而在HQ處理組中，胞質出現大量空泡，細胞呈蜂窩狀，伴有自噬樣改變。高倍鏡下(×15 000)可以觀察到HQ處理組細胞中存在大量雙膜結構，內含待降解的細胞器成分的自噬體，未和自噬體融合的溶酶體以及自噬末期出現的單層膜的自噬溶酶體，其中包裹的細胞器成分已降解，見圖1。

圖1 透射電鏡檢測不同劑量HQ誘導L-02細胞自噬體形成

2.2 HQ對L-02細胞GFP-LC3B融合蛋白形成的影響AdPlus-mCherry-GFP-LC3B是一種重組腺病毒，用于感染細胞后的自噬檢測。GFP信號對溶酶體腔內的酸性和/或蛋白水解條件敏感，而mCherry則更穩定。因此，GFP和mCherry熒光的共定位表明自噬體未與溶酶體融合。在非自噬的情況下，mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光形式存在于細胞質中，而在自噬的情況下，GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色的斑點的形式表現出來，當自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點的形式表現出來。實驗結果顯示，黃色斑點熒光的數量隨著HQ作用劑量的升高而增多，而紅色的片狀斑點有明顯減少的趨勢，見圖2。

圖2 不同劑量HQ對L-02細胞瞬時轉染GFP-LC3B表達的影響

2.3 HQ對L-02細胞自噬蛋白表達的影響與對照組比較，HQ處理提高了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(F=6.10,P<0.01)的蛋白質表達水平；但對Beclin-1(F=0.20,P>0.05)和P62(F=1.70,P>0.05)蛋白表達無明顯影響，見圖3。

圖3 HQ對L-02細胞自噬蛋白表達的影響

2.4 HQ對L-02細胞自噬相關蛋白亞細胞定位的影響免疫熒光結果顯示，LC3蛋白在細胞核和細胞質中均有表達，主要分布于細胞核中，HQ處理后LC3在細胞核周圍聚集，熒光強度均明顯高于對照組；Beclin-1在細胞核和細胞質均有表達，HQ處理組Beclin-1的亞細胞定位及熒光強度與對照組差異無統計學意義；在對照組和低劑量HQ處理組(10、20 μmol/L)中，P62蛋白只在細胞質中表達，而在高劑量HQ處理組中，觀察到P62蛋白在細胞質與細胞核中均有表達，見圖4。

圖4 HQ對L-02細胞自噬相關蛋白亞細胞定位的影響 ×630

3 討論

研究[5]表明，自噬與許多化學物引起的細胞毒性機制如線粒體功能障礙、DNA損傷、氧化應激、內質網改變、溶酶體功能受損和炎癥等密切相關。不受調控的自噬嚴重影響重要的細胞過程，如程序性細胞死亡，從而在許多疾病的發病機制中發揮關鍵作用。然而，其根本機制目前仍不清楚。HQ已被其他體外實驗證明可以在一些細胞中誘導自噬[6-7]，而目前HQ對肝細胞的自噬影響及機制尚不明確。在透射電鏡下通過測量自噬體的形成研究自噬活性，是最廣泛被接受的監測自噬的方法之一[8]。本研究中，電鏡下觀察到HQ作用L-02細胞后出現自噬樣改變，自噬體和自噬溶酶體結構顯著增多，證實HQ可以誘導L-02細胞自噬體的生成。mCherry-GFP-LC3B實驗結果表明HQ誘導自噬體增多但自噬溶酶體減少，這說明HQ處理可能導致L-02細胞自噬體和溶酶體融合受阻。

自噬過程是動態變化的，而自噬體僅是整個自噬通路過程中的一個中間結構，因此自噬通量檢測較單純自噬體檢測更能反映自噬活性。目前，用于監測自噬通量的常用標志物主要有LC3、Beclin-1和P62蛋白。LC3是自噬體膜上的標志性蛋白，在自噬過程中，胞漿型LC3Ⅰ會被泛素化修飾加工成膜型LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值變化可以評價自噬體的形成；Beclin-1是自噬啟動的核心蛋白之一；而P62則是一種多功能癌基因蛋白，參與了靶向底物進入自噬體的降解過程[9]。本研究結果顯示，HQ作用可以顯著提高L-02細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比值，這表明HQ的作用促進了L-02細胞的自噬體生成；而Beclin-1表達未受HQ影響，提示HQ可能通過非Beclin-1依賴途徑影響自噬[10]。P62的表達在HQ處理前后都沒有明顯變化，提示HQ可能沒有改變肝細胞的自噬流或自噬狀態，但結合本研究的其他結果，P62變化不明顯的更可能的解釋是HQ作用可能誘使P62的轉錄活性降低，使其翻譯產生的P62蛋白減少，雖然自噬流阻滯減少了P62蛋白的消耗，但表現出細胞內P62蛋白水平沒有明顯變化，這需要進一步檢測P62的轉錄活性加以證明[11]；此外，還可能由于P62參與Ras、Raf、MAPK和NF-κB等信號通路的調節，P62參與的其他細胞過程消耗了因自噬流阻滯所帶來的升高部分[12]。免疫熒光實驗發現了LC3在細胞核和細胞質均有表達，LC3能夠在細胞質和細胞核之間循環，當細胞營養缺乏時，細胞核內的LC3能夠被去乙酰化酶SIRT1去乙酰化，促進其回到細胞質中[13]。LC3的核功能可能與其促進自噬降解細胞核纖層元件，誘發細胞衰老，從而防止自身癌變有關[14]。Beclin-1存在于胞漿和核定位，Beclin-1的核定位一般與其非自噬功能相關。此外，本研究還發現高劑量HQ可以誘導L-02細胞內的P62由胞質向胞核轉位現象。結果表明，P62可能參與了細胞核內DNA損傷的應答過程[15]。