BoneCeramic與Bio-Oss促進大鼠PAOO術后成骨與骨髓基質細胞成骨分化效果的比較研究

李偉瓊，張雨晴，徐建光，張紅艷

隨著生活水平提高越來越多的成年人尋求正畸治療[1]，但成年人治療時間較長，同時易發生牙周破壞等情況[2-4]。為此正畸科醫師提出牙周加速成骨正畸(periodontally accelerated osteogenic orthodontics,PAOO)這一觀點[5-6]。PAOO是指在相關區域牙槽骨進行骨皮質切開，移植顆粒骨并結合正畸牙移動，從而達到加速牙齒移動，增加牙槽骨骨量的目的[7-8]。研究[9]表明當牙根唇頰側牙槽骨厚度<2 mm時，骨皮質切開的同時需要植骨，同時材料的降解速率應當適中，不能影響牙齒的移動[10]。目前PAOO術中常用的骨移植材料為Bio-Oss[11]，但相關研究[12]表明Bio-Oss在植入數年后未完全吸收。BoneCeramic是一種純合成骨移植材料，由40%β-磷酸三鈣(betatricalcium phosphate，β-TCP)和60%羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)組成[13]。該研究通過比較BoneCeramic與Bio-Oss促進大鼠PAOO術后成骨與骨髓基質細胞成骨分化效果，探討BoneCeramic 作為純合成骨移植材料是否能夠增加SD大鼠PAOO術后牙槽骨骨量及其及相關機制，為未來的臨床實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器普通級8周雄性SD大鼠36只、SPF級3.5周齡雄性SD大鼠4只(安徽醫科大學動物實驗中心)；Bio-Oss(瑞士Geistlich Pharma公司)；BoneCeramic (瑞士Switzerland 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技公司)；CCK-8試劑(日本同仁公司)；堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；鎳鈦拉簧(上海埃蒙迪材料科技股份有限公司)；細胞培養箱(美國Therno公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)；超聲骨刀(中國啄木鳥醫療器械有限公司)。

1.2 動物實驗

1.2.1動物實驗分組 將36只SD大鼠隨機分成3組：骨皮質切開組(CO組)；骨皮質切開+Bio-Oss植入組(BO組)；骨皮質切開+BoneCeramic植入組(BC組)。所有大鼠飼養在安徽醫科大學動物實驗室內，動物護理和實驗步驟按照安徽醫科大學動物護理和使用委員會指南進行。

1.2.2骨皮質切開術與骨粉材料植入 用1%戊巴比妥鈉(4 ml/kg)麻醉大鼠后，在大鼠右上第一磨牙腭側及近中作切口，翻瓣，暴露右上第一磨牙近中及腭側牙槽骨骨面。用超聲骨刀在生理鹽水沖洗下在右上第一磨牙腭側靠近近中牙槽骨根尖區域處作長5 mm、寬1 mm、深0.5 mm的切口，深至骨髓質。CO組在血液充盈創口后縫合。BO組在進行骨皮質切開術后，在牙槽骨骨面植入Bio-Oss骨粉，待血液充盈后，黏骨膜復位，嚴密縫合。BC組植入BoneCaremic骨粉，后續處理同BO組。對于兩骨粉植入組所植入骨粉量相同，每只大鼠骨粉植入量均為0.05 g。三組大鼠術后均給予抗生素治療3 d。

1.2.3正畸牙移動模型建立 骨皮質切開術當天，用0.2 mm的不銹鋼結扎絲將鎳鈦閉合彈簧圈固定在右上頜第一磨牙和上頜2個中切牙上，激活彈簧，50 N/kg力將磨牙拉向近中(見圖1)。為確保穩定性，在上頜中切牙遠中盡可能靠齦方各磨出一凹槽使結扎絲通過，并用自凝樹脂固定。因嚙齒動物的門齒是不斷生長的，所以每7 d調整中切牙不銹鋼絲結扎位置。在28、60 d分別從三組內隨機抽取6只大鼠處死，分離右側上頜骨第三磨牙至中切牙區域骨段，用甲醛浸泡固定進行micro-CT檢測。

圖1 正畸牙齒移動模型

1.2.4micro-CT檢測 Micro-CT掃描所有標本后進行三維圖像重建，牙齒移動距離是從第一磨牙牙冠最遠中到第二磨牙牙冠最近中進行測量(圖2A)。為了評估右上第一磨牙腭側牙槽骨高度喪失(alveolar bone height loss,ABHL)的距離，在重建的三維圖像上測量第一磨牙腭側近中、中間、遠中三個點的ABHL距離即測量釉牙骨質界(cemento-enamel junction,CEJ)至牙槽嵴頂(alveolar bone crest，ABC)之間距離，取三者平均值，所有圖像都重新定向，使釉牙骨質界和根尖出現在同一個CT切片上(圖2B)。在上頜第一磨牙周圍繪制相關感興趣區域(region of interest,ROI)，它的范圍在垂直方向上為第一磨牙牙槽嵴最高點至根尖點、近遠中方向上為第一磨牙最近中點至最遠中點，頰舌側方向上為牙槽骨頰側骨板至舌側骨板所形成的區域(圖2C)，隨后進行該區域骨體積分數(bone volume fraction,BVF)測量,BVF=骨骼的礦化組織/感興趣區域的總體積。

圖2 Micro CT正畸牙齒分析

1.3 體外實驗

1.3.1骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分離培養 將3周齡大鼠脫頸處死，分離股骨和脛骨，減去兩端，露出骨髓腔。用培養液沖洗骨髓腔，反復 3次。收集骨髓懸液置于15 ml離心管中，離心，棄上清液，用培養液重懸細胞，轉移至培養皿，置于培養箱中進行培養，3 d換液一次，細胞生長至80%～90%時傳代，傳代第2～3代用于后續細胞實驗。

1.3.2CCK-8檢測 將BoneCeramic和Bio-Oss在無菌條件下分別加入到含10%胎牛血清的培養基中浸泡48 h(濃度為0.1 g/ml)，過濾獲得浸提液。將BMSCs以密度為4 ×104/ml接種在96孔板中，24 h懸浮細胞貼壁后，加入浸提原液，對照組加入正常培養液，3 d換液一次。在第1、3、5 天后進行CCK-8測試。

1.3.3SEM檢測 將Bio-Oss和BoneCeramic加入至離心管中,接種密度為1×106/ml的BMSCs,培養3 d后，戊二醛固定過夜，PBS清洗3次。無水乙醇脫水，干燥、鍍金，SEM下進行觀察。

1.3.4ALP定量檢測 將Bio-Oss和BoneCeramic無菌環境下，分別置于6孔板中,BMSCs以密度為5×105/ml接種在6孔板中，培養24 h后，將生長培養液(growth medium,GM)換為成骨培養液(osteogenic medium,OM)，3 d換液一次。A組：BMSCs+GM；B組：Bio-Oss+BMSCs+OM； C組：BoneCeramic+BMSCs+OM；D組：BMSCs+OM。在更換培養液后的第4、7、10 天用堿性磷酸酶試劑盒檢測細胞培養液上清中堿性磷酸酶的活性水平。

1.3.5q-PCR檢測 按照ALP定量檢測方法和操作步驟,在第7、14天萃取細胞總RNA，PrimeScriptbTM RT reagent Kit進行逆轉錄，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ進行q-PCR，檢測RUNX-2、OPN 和OCN的水平。以GAPDH為內參，引物序列見表1。

表1 q-PCR引物序列表

2 結果

2.1 牙齒移動距離是否植入骨移植材料及其種類對牙齒移動無影響，CO、BO、BC三組在28、60 d時的牙齒移動距離差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 右上第一磨牙移動距離

2.2 ABHL檢測結果28 d時CO組ABHL(0.893±0.041)mm明顯高于BO、BC組，差異有統計學意義(P<0.05)，BO組ABHL(0.763±0.039)mm稍高于BC組(0.735±0.037)mm，但差異無統計學意義。60 d時CO組ABHL(1.318±0.038)mm明顯高于BO、BC組，差異有統計學意義(P<0.05)，BO組ABHL(0.828±0.037)mm高于BC組(0.761±0.036)mm，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 ABHL高度

2.3 BVF測量結果與CO組比較，在28、60 d時BO、BC組BVF升高，差異有統計學意義(P<0.05)；60 d時，BC組BVF明顯高于BO組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 相關區域BVF測量

2.4 BMSCs觀察原代時，BMSCs呈圓形，胞體透亮，大小不一，與周圍的血細胞相互混雜。3 d換液后可見大量貼壁細胞，9～10 d細胞逐漸融合成片，相互緊密貼附生長。第3代時可見細胞紡錘形,呈典型的漩渦狀生長。見圖6。

圖6 大鼠BMSCs體外培養觀察

2.5 骨粉浸提液對BMSCs增殖的影響與CO組比較，在第3、5天時BO、BC組OD值均有所增高，差異有統計學意義(P<0.05) ，且在第5天時BC組略高BO組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 CCK-8檢測骨粉浸提液對BMSCs增殖的影響

2.6 BMSCs在骨材料表面的分布情況Bio-Oss表面觀察到少數BMSCs，并且細胞與材料貼合不緊密。與Bio-Oss比較,BMSCs在BoneCeramic表面分布更多并且更緊密。見圖8。

圖8 SEM觀察

2.7 ALP活性情況在第4、7、10天時B、C、D組ALP活性均高于A組，差異有統計學意義(P<0.05) 。在第7、10天時B組和C組活性高于D組，且C組高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖9。

圖9 ALP活性定量檢測

2.8 成骨相關基因RUNX2、OPN、OCN的mRNA的表達情況與A組比較，在第7、14天時B、C、D組的成骨相關基因RUNX2、OPN、OCN的mRNA相對水平都顯著增高(P<0.05)，同時，B、C組高于D組，并且C組高于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖10。

圖10 mRNA相對表達量

3 討論

成人正畸治療應在保證牙齒周圍有足夠健康的牙周組織的前提下，適當的增加牙齒移動的速率。PAOO技術可以加速正畸牙移動，并且通過植骨拓寬了正畸范圍。Bio-Oss在PAOO術中作為骨移植材料已有相關文獻報道，但本研究希望尋找一種適合PAOO術后正畸牙齒移動的骨移植材料，既可以達到骨增量的效果，又有著合適的降解速率。

CO、BO、BC三組第一磨牙近中移動距離均差異無統計學意義，表明在PAOO術中植入骨粉材料不影響牙齒移動速度。CO組在28、60 d時第一磨牙腭側ABHL高于BO、BC組而BVF明顯低于BO、BC組，這與Brugnami et al[14]認為骨皮質切開(不植骨)牙槽骨高度明顯低于骨皮質切開(植骨)結果相吻合，表明大鼠在PAOO術中植入骨材料可以增加術區牙槽骨骨量。在28、60 d時，BO組ABHL高于BC組及BVF明顯低于BC組，BO、BC兩組之間的差異表明大鼠PAOO術中植入BoneCeramic比植入Bio-Oss更有利于增加術區牙槽骨骨量。這個結果可能是由于BoneCeramic是一種雙相磷酸鈣,結合了HA的生物相容性和β-TCP的良好性降解速率[15]，可以在相對較短的時間內被吸收并被再生骨組織所取代。

體外實驗CCK-8、SEM結果表明兩種骨粉材料對BMSCs生長無抑制作用； ALP結果表明BMSCs接種于骨粉材料表面上更有利于其成骨分化，這主要是由于骨粉材料三維支架結構加大細胞的生長空間，使得細胞和骨粉材料的接觸面積加大，減少接觸抑制，從而促進BMSCs的成骨分化。同時細胞接種于BoneCaremic骨粉上比Bio-Oss上更有利于其分化，這一結果表明BoneCaremic材料的空間結構更有利于BMSCs黏附、生長、成骨分化。q-PCR檢測結果也證實了這一結論。

經過一系列實驗的結果表明，在體內，與Bio-Oss、BoneCeramic更有利于大鼠PAOO術后成骨；在體外，BoneCeramic有著與Bio-Oss同樣優異的生物相容性,并且成骨性能更優異。本研究首次在大鼠模型上比較BoneCeramic和Bio-Oss在PAOO術后成骨的效果，為成年人正畸在安全快速移動牙齒的基礎上，增加牙槽骨骨量提供新的實驗依據和治療方法。BoneCeramic是一種新型的純合成骨移植材料，具有較好的骨引導再生作用，可以有效增加牙槽骨骨量，而且具有合適的降解率，未來有望可以運用在正畸臨床中。