SETDB1通過p53/p21通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞衰老

吳 倩，侯吉學(xué)，賀 強(qiáng)，崔曉賓，黃桂林，孫旭凌

結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率與死亡率分別居于第3位和第5位[1]。目前，針對結(jié)腸癌的靶向治療研究在臨床上受到越來越多的重視[2-3]，關(guān)于結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的研究得到廣泛關(guān)注。研究[4]顯示，在部分相關(guān)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中，細(xì)胞衰老扮演著重要角色。結(jié)腸癌細(xì)胞中存在一種屬于組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶的組蛋白甲基化酶 SET結(jié)構(gòu)域分支型1(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1)，其編碼基因的位置在人類染色體 1q21 上，其過度表達(dá)和下調(diào)廣泛存在于多種惡性腫瘤中[5-7]，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。鑒于課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SETDB1可以影響細(xì)胞衰老[8]，遂以結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對象，擬進(jìn)一步探討SETDB1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的靶向治療策略提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、SW480由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科提供；多柔比星(doxorubicin,DOX)購于德國Sigma公司；衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)試劑盒、CCK8 試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；p53和p21抗體、SETDB1和GAPDH購于美國圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司；針對 SETDB1的 shRNA、過表達(dá)質(zhì)粒與p53質(zhì)粒購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；高糖培養(yǎng)基及嘌呤霉素等購于武漢啟動子生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立 shRNA慢病毒用于感染預(yù)鋪在6孔板中的SW480細(xì)胞(每孔約5×104個細(xì)胞)，首先5 μg/ml慢病毒感染細(xì)胞12 h，其次將培養(yǎng)基更換成高糖培養(yǎng)基。感染 72 h后，再將培養(yǎng)基更換為含2 μg/ml 嘌呤霉素的培養(yǎng)基。之后每2 d更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，直到對照細(xì)胞完全死亡。使用MD2-G、PAX、pLKO-SETDB1三包系統(tǒng)進(jìn)行高表達(dá)病毒包裝，包裝好的慢病毒立即感染HT29細(xì)胞系。

1.2.2細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色 將高表達(dá)SETDB1的HT29細(xì)胞及對照組細(xì)胞、低表達(dá)SETDB1的SW480細(xì)胞及對照組細(xì)胞預(yù)鋪在6孔板中(每孔約5×104個細(xì)胞)，用DOX 0.25 μmol/L誘導(dǎo)不同組別的HT29細(xì)胞或SW480細(xì)胞，加β-半乳糖苷酶染色固定液1 ml，25 ℃靜置30 min，PBS沖洗3次。每孔均加1 ml染色工作液，封口膠封閉6孔板保存在無CO2的37 ℃溫箱中15 min，于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3CCK8檢測 將DOX預(yù)處理的HT29細(xì)胞及DMSO處理的對照組細(xì)胞、高表達(dá)SETDB1的HT29細(xì)胞及對照組細(xì)胞、低表達(dá)SETDB1的SW480細(xì)胞及對照組細(xì)胞鋪在96孔板中(每孔3 000個細(xì)胞)，設(shè)復(fù)孔3個。待細(xì)胞貼壁，分別于0、24、48、72 h后，將混有10 μl CCK8的培養(yǎng)基100 μl加入每孔當(dāng)中，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測后繪制各時間點(diǎn)細(xì)胞生長曲線，比較細(xì)胞生長情況。

1.2.4Western blot檢測 用蛋白裂解液提取不同處理組的細(xì)胞蛋白，計算好蛋白樣品濃度及上樣量。加樣以SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉孵育一抗1 h，4 ℃ 7 h，第2天孵育對應(yīng)的二抗2 h，TBST洗30 min，利用ECL發(fā)光劑在曝光機(jī)下拍照。

1.2.5細(xì)胞周期檢測 將DOX預(yù)處理的HT29細(xì)胞及DMSO處理的對照組細(xì)胞分別用胰酶消化后，低速離心棄上清液，在4 ℃環(huán)境下每管加入預(yù)冷的80%乙醇固定細(xì)胞7 h，低速離心洗滌棄上清液，分別將200 μl binding buffer、5 μl PI和5 μl RNase加入，吹打均勻后常溫避光靜置30 min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SETDB1在DOX誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞衰老模型中表達(dá)于HT29細(xì)胞中加入DOX 0.25 μmol/L誘導(dǎo)2 d，細(xì)胞衰老現(xiàn)象明顯增加，以此確認(rèn)SETDB1是否參與了結(jié)腸癌細(xì)胞衰老(圖1A)。誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖活性呈顯著降低趨勢(t=10.242,P<0.001，圖1B)。同時誘導(dǎo)組細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯，證明DOX誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的衰老模型構(gòu)建成功(圖1C、D)。另收集細(xì)胞行Western blot檢測SETDB1的蛋白表達(dá)量，結(jié)果誘導(dǎo)組中SETDB1蛋白表達(dá)量較對照組明顯下降，提示結(jié)腸癌細(xì)胞衰老過程中或許有SETDB1蛋白參與(圖1E)。

圖1 SETDB1在DOX誘導(dǎo)的結(jié)腸癌衰老模型中的表達(dá)

2.2 SETDB1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響SETDB1在SW480細(xì)胞系和HT29細(xì)胞系均有表達(dá)，但表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2A)。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別建立穩(wěn)定低表達(dá)SETDB1的SW480細(xì)胞系和高表達(dá)HT29細(xì)胞系，并經(jīng)Western blot檢測證實(shí)(圖2B、C)。在96 孔板中接種不同組細(xì)胞，CCK8 法檢測不同組細(xì)胞在0、24、48和72 h時的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SETDB1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖(F=25.527,P<0.001，圖2D)，而高表達(dá)SETDB1可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖(t=-6.328,P<0.01，圖2E)。

圖2 SETDB1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況的影響

2.3 SETDB1對結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的影響利用β-半乳糖苷酶染色法對用DOX誘導(dǎo)后的穩(wěn)定低表達(dá)SETDB1的SW480細(xì)胞和穩(wěn)定高表達(dá)SETDB1的HT29細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察不同組細(xì)胞中染色情況。結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力在STEDB1低表達(dá)后下降，衰老細(xì)胞占比從(22.00±4.35)%增加至(54.00±5.56)%和(53.33±4.93)%(F=40.484,P<0.001，圖3A、B)；結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力在過表達(dá)STEDB1后上升，衰老細(xì)胞比例從(43.33±6.11)%降低至(21.33±3.51)%(t=5.407,P<0.01，圖3C、D)。

圖3 SETDB1對結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的影響

2.4 SETDB1可對p53/p21通路進(jìn)行調(diào)控GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SETDB1的表達(dá)與P53信號通路相關(guān)(圖4A)，由Western blot證實(shí)p53及p21的蛋白水平在低表達(dá)SETDB1組細(xì)胞明顯增高(圖4B)，反之，過表達(dá)SETDB1可抑制p53及p21的蛋白表達(dá)(圖4C)，提示改變SETDB1的表達(dá)可調(diào)節(jié)p53/p21 信號通路。進(jìn)一步檢測Vector、SETDB1及SETDB1+p53組細(xì)胞衰老水平，過表達(dá)SETDB1后結(jié)腸癌細(xì)胞衰老比例從(52.33±5.51)%降至(21.67±5.03)%(t=7.119,P<0.01，圖4D)，經(jīng)過p53 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，衰老細(xì)胞的占比則再次升至(40.67±4.04)%(t=-5.098,P<0.01，圖4E)，由此證明過表達(dá)p53可以逆轉(zhuǎn)高表達(dá)SETDB1引起的細(xì)胞衰老減少,說明結(jié)腸癌的細(xì)胞衰老可能是由SETDB1影響p53/p21信號通路調(diào)控來影響腫瘤的增殖。

圖4 SETDB1通過p53/p21通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞衰老

3 討論

近年來，組蛋白相關(guān)功能的研究逐漸被醫(yī)學(xué)界所重視。組蛋白甲基化由27種不同的甲基轉(zhuǎn)移酶共同完成，這些甲基轉(zhuǎn)移酶在特定的點(diǎn)起作用，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。當(dāng)甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮非組蛋白的功能，可修飾p53細(xì)胞衰老[9-11]。目前參與細(xì)胞衰老調(diào)控的信號通路主要有p53/p21通路、Wnt/β-catenin通路，其中 p53/p21通路最為重要[12-13]。研究[14]表明，SETDB1是參與p53穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的重要調(diào)節(jié)器之一。為確定SETDB1是否會直接影響p53，利用GEO數(shù)據(jù)測序分析富集后呈現(xiàn)結(jié)果為低表達(dá)SETDB1時p53表達(dá)上調(diào)。

結(jié)腸癌是致人死亡的主要疾病之一。如何抑制結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移的方式既是臨床工作重點(diǎn)，也是基礎(chǔ)科研的主攻方向。SETDB1或許在結(jié)腸癌中起了癌基因的作用，但其作用機(jī)制未完全闡明，需要進(jìn)一步的研究來探索其分子機(jī)制。課題組在前期研究[8]中所建立的細(xì)胞衰老模型中發(fā)現(xiàn)，升高或降低SETDB1的表達(dá)量可以影響細(xì)胞衰老。近來臨床研究[15]證實(shí)，細(xì)胞衰老在抗腫瘤和促進(jìn)腫瘤發(fā)生特性的調(diào)節(jié)中SETDB1起到核心作用。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，SETDB1在非小細(xì)胞肺癌患者中反復(fù)擴(kuò)增和高表達(dá)。靶向SETDB1的抑制劑可能使過表達(dá)SETDB1的非小細(xì)胞肺癌患者受益。本研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞衰老的過程中，SETDB1蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示腫瘤衰老的過程有SETDB1參與。并且進(jìn)一步通過慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定低表達(dá)RNA構(gòu)建了低表達(dá)SETDB1的結(jié)腸癌細(xì)胞模型以此來闡明SETDB1可否調(diào)節(jié)結(jié)腸腫瘤的衰老。通過β-半乳糖苷酶染色提示SETDB1低表達(dá)確實(shí)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的衰老，其低表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖由CCK8實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步揭示。以上證據(jù)證明，SETDB1通過p53/p21通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞衰老進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長方式，對腫瘤起到調(diào)控作用。綜上所述，本研究為SETDB1通過激活 p53/p21通路參與結(jié)腸癌細(xì)胞衰老過程提供了依據(jù)。