組織蛋白酶S對人骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其機制

紀海茹，孔令偉，曹 勝，呂家興，李佳欣，劉春雨，金 宇

骨肉瘤作為最常見的原發性惡性骨腫瘤，常伴有突變和轉移，患者預后極差。雖然化療和手術可以讓骨肉瘤患者生存率有所提高，但轉移性或復發性骨肉瘤患者的存活率仍然很低，患者5年總體生存率不到20%[1]。由于腫瘤的惡性進展依賴于腫瘤相關分子的調控，因此尋找與骨肉瘤惡性表型和臨床預后相關的新型標記物尤為重要。組織蛋白酶S (cathepsin S,Cat S)作為半胱氨酸蛋白酶家族的主要成員，可通過調控結締組織和基底膜的溶解和重塑，影響機體炎癥和免疫反應，并最終促進腫瘤生長[2]。近年來文獻報道[3-4]，Cat S在肝細胞癌等多種癌癥中高表達，并對腫瘤細胞的惡性表型例如增殖和侵襲發揮促進作用。然而，尚未有研究報道Cat S在骨肉瘤中的具體作用。該研究旨在探討Cat S對人骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材人正常成骨細胞(hFOB)和人骨肉瘤細胞(SAOS2和MG63)購自中國科學院上海細胞研究所；DMEM培養基(貨號：170217083240)、10%胎牛血清(貨號：SH30070.03E)、1%鏈霉素/青霉素(貨號：SV30010)和胰蛋白酶(貨號：SH30042.01)購自美國Hyclone公司；TRIzol RNA裂解液(貨號：GS101-01)、RIPA蛋白裂解液(貨號：T15196)和BCA蛋白定量試劑盒(貨號：KL80816-500)購自北京全式金生物有限公司；Transwell小室(貨號：3413)和Matrigel基質膠(貨號：HYC021M01)購自美國Corning公司；Cat S特異性siRNA干擾序列(si-Cat S)和陰性對照序列(si-NC)合成自美國Qiagen公司；cDNA逆轉錄試劑盒和快速定量SYBR?Green RT-PCR試劑盒購自美國Sigma公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒和LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；一抗：Bcl-2、Bax、LRP5、β-catenin、C-myc、Cyclin D1和GAPDH購自美國Cell Signaling公司；二抗：辣根過氧化酶標記的兔抗羊IgG購自美國Abcam公司；PCR引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；其他常見分子生物學相關試劑與耗材購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將正常人成骨細胞(hFOB)和人骨肉瘤細胞(SAOS2和MG63)用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養基進行培養。所有細胞均放置在5%的CO2培養箱中培養，溫度控制在37 °C，相對濕度為95%。細胞每3 d更換一次培養基，待細胞融合度達到80%以上時進行傳代培養。取3代以后的對數期細胞用于后續實驗研究。

1.2.2細胞轉染與分組 將對數期的人骨肉瘤細胞SAOS2及MG63按照3×105個/孔的密度接種到6孔板中，待細胞融合度達到80%并貼壁生長時，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒操作說明書將si-Cat S和si-NC轉染至SAOS2和MG63細胞中。經過48 h的轉染，采用RT-PCR檢測轉染效率。本研究中的實驗細胞共分為4組：hFOB組(hFOB細胞)、Control組(未轉染的SAOS2或MG63細胞)、si-NC組(轉染了si-NC的SAOS2或MG63細胞)和si-Cat S組(轉染了si-Cat S的SAOS2或MG63細胞)。siRNA-Cat S和陰性對照序列分別為5′-CTACAAAGCCACGGATGAA-3′和5′-TTCGCGACAAAACAGACGA-3′。

1.2.3CCK-8法和克隆形成實驗檢測人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63的增殖活性 CCK-8實驗：將轉染后的SAOS2和MG63細胞按照3×103個/ml的密度接種到96孔板中，設置3個重復孔，加入DMEM完全培養基100 μl/孔。這些細胞在37 ℃和5%CO2培養箱中分別培養0、24、48和72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液繼續孵育1 h。通過酶標儀檢測各組細胞在450 nm波長處的光密度值。 克隆形成實驗：將轉染后的SAOS2和MG63細胞按照900個/孔的密度接種到6孔板中，常規培養14 d后形成自然集落。培養結束后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗細胞3次后，在室溫下用0.2%的結晶紫染色30 min。染色結束后在倒置光學顯微鏡下對菌落進行拍照和計數分析。

1.2.4劃痕實驗檢測人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63的遷移能力 將轉染后的SAOS2和MG63細胞按照1×104個/孔的密度接種到24 孔板中常規培養24 h。等細胞融合度達到90%以上時，用200 μl的無菌移液管尖端垂直于孔板表面輕輕劃過，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗劃痕處3次。在倒置光學顯微鏡下觀察創面形成后0和24 h的愈合情況，測量細胞的遷移距離并計算遷移率。

1.2.5Transwell實驗檢測人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63的侵襲能力 將轉染后的SAOS2和MG63細胞按照5×104個/ml的密度制成細胞懸液。將100 μl的無血清細胞懸液加入已鋪好Matrigel膠的Transwell上室，下室加入600 μl的含10%胎牛血清的DMEM完全培養基。細胞在37 ℃和5%CO2的培養箱中培養24 h。培養結束后先用4%的多聚甲醛對上室細胞固定10 min后再在室溫下用0.5%結晶紫染色15 min。染色后的細胞在倒置光學顯微鏡下拍照并計數分析。

1.2.6RT-PCR法檢測人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63中的mRNA表達 用TRIzol RNA提取液從轉染后的SAOS2和MG63細胞中分離和提取全部RNA。以cDNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。為了評估Cat S mRNA水平，嚴格按照快速定量SYBR?Green RT-PCR試劑盒操作說明進行RT-PCR檢測。RT-PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性40次每次10 s，60 ℃退火延伸30 s，共計45個循環。用2-ΔΔCt方法計算Cat S的相對含量，并以GAPDH作為內參。PCR引物序列包含2部分，Cat S引物序列F:5′-GCCTGATTCTGTGGACTGG-3′，R:5′-GATGTACTGGAAAGCCGTTGT-5′；GAPDH引物序列F:5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′，R:5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′。

1.2.7Western blot法檢測人骨肉瘤細胞中相關蛋白的表達 用RIPA細胞裂解液從轉染后的SAOS2細胞中提取全部蛋白質樣品。通過BCA蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白的濃度。蛋白變性后每孔上樣量為20 μg，經12% SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉封閉液對PVDF膜進行封閉2 h，然后與一抗在4 ℃下共孵育2 h。培養結束后，用TBST洗膜3次后，二抗繼續孵育1 h。最后，通過增強的ECL化學發光成像系統顯示蛋白條帶并采用Image J軟件對蛋白進行定量分析。

2 結果

2.1 Cat S在人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63中的表達通過RT-PCR和Western blot法檢測了Cat S在正常人成骨細胞(hFOB)和人骨肉瘤細胞(SAOS2和MG63)中的表達。如圖1A所示，Cat S在正常細胞hFOB中的表達為低于人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63中的蛋白表達(t=17.35,P<0.001)，差異有統計學意義。同時，如圖1B所示， Western blot結果顯示，三組內參GAPDH的表達相近，相比較正常細胞hFOB，Cat S在人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63中的mRNA表達水平上調(t=17.18,P<0.001)，差異有統計學意義。上述結果提示了Cat S的異常表達可能與骨肉瘤的發生發展有關。

2.2 siRNA沉默Cat S基因對人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63增殖活性的影響為了研究Cat S在人骨肉瘤細胞生長過程中的作用，通過siRNA干擾降低Cat S在SAOS2和MG63中的表達。如圖2A所示，與si-NC組比較，si-Cat S組中Cat S的表達下調(P<0.001)。接下來，通過CCK-8和克隆形成實驗檢測了敲低Cat S對SAOS2和MG63細胞增殖活性的影響。如圖2B所示，與si-NC組比較，si-Cat S組中SAOS2和MG63細胞的增殖活性明顯降低(t=9.12,P<0.001)，差異有統計學意義。如圖2C所示，與si-NC組比較，si-Cat S組中SAOS2和MG63細胞集落數目明顯減少(t=9.38,P<0.001)，差異有統計學意義。以上結果顯示，敲低Cat S能有效抑制SAOS2和MG63細胞的增殖活性。

2.3 siRNA沉默Cat S基因對人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63遷移和侵襲能力的影響通過劃痕實驗和Transwell實驗檢測敲低Cat S對SAOS2和MG63細胞遷移和侵襲能力的影響。如圖3A所示，與si-NC組比較，si-Cat S組中SAOS2和MG63細胞的遷移能力受到抑制，差異有統計學意義(F=16.52,P<0.001)。如圖3B所示，與si-NC組比較，si-Cat S組中SAOS2和MG63細胞的侵襲能力受到抑制，差異有統計學意義(F=12.19,P<0.001)。

圖1 Cat S蛋白在正常人成骨細胞hFOB和人骨肉瘤細胞SAOS2及MG63中的表達水平

圖2 siRNA沉默Cat S基因對人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63增殖活性的影響

圖3 siRNA沉默Cat S基因對人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63遷移和侵襲能力的影響

2.4 siRNA沉默Cat S基因對骨肉瘤SAOS2細胞凋亡的影響Western blot實驗用于檢測敲低Cat S對SAOS2細胞凋亡的影響。如圖4所示，與si-NC組比較，si-Cat S組抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，而促進促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達上調(t=9.12,P<0.001)，差異有統計學意義。以上結果顯示，敲低Cat S能誘導SAOS2和MG63細胞凋亡。

圖4 siRNA沉默Cat S基因對骨肉瘤SAOS2細胞凋亡的影響

2.5 siRNA沉默Cat S基因對骨肉瘤SAOS2細胞Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響Western blot實驗檢測了Cat S對人骨肉瘤細胞Wnt/β-catenin通路的調控作用。如圖5所示，與si-NC組比較，si-Cat S組細胞中Wnt/β-catenin通路相關蛋白LRP5、β-catenin、C-myc和Cyclin D1的表達下調(t=17.32,P<0.001)，差異有統計學意義。綜合上述結果表明，Cat S能在人骨肉瘤細胞中發揮促癌作用加劇癌細胞的生長，其機制可能與Wnt/β-catenin通路的激活有關。

圖5 siRNA沉默Cat S基因對骨肉瘤SAOS2細胞Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響

3 討論

Cat S作為一種溶酶體酶有前體和成熟型兩種形式，其被激活后首先會被分泌到細胞表面，然后再進入到細胞外環境中發揮作用[5]。有報道[6]稱Cat S已被證實在包括肝細胞癌、腦癌和結腸癌等在內的一系列人類腫瘤類型中表達失控，同時Cat S表達的上調能誘導腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管生成。如，Cat S在肝癌細胞MHCC97-H中高表達，且抑制Cat S的表達可以有效抑制肝癌細胞增殖，遷移和血管生成[7]。在胃癌中，Cat S在16個胃癌細胞系和115個胃癌臨床樣本中高表達，且沉默Cat S可以有效抑制體外胃癌細胞的遷移和侵襲[8]。此外，Cat S還可以通過水解血腦屏障中的JAM-B蛋白促進腫瘤細胞滲入大腦，而抑制Cat S的表達可明顯減少腦轉移[9]。因此，Cat S被普遍認為是腫瘤治療的新的潛在靶點。本研究發現Cat S在人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63中高表達，敲低Cat S基因可以有效抑制人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63的增殖、遷移和侵襲，并促進凋亡，提示了Cat S與骨肉瘤的發生發展密切相關并發揮著促癌作用。

Wnt/β-catenin信號通路已被諸多研究表明在癌癥及骨質疏松等疾病過程中發揮了重要作用[10]。作為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調控因子，β-catenin的異常表達通常會導致細胞不能通過磷酸化和泛素化將其降解而致使β-catenin積累。隨后，過量的β-catenin會進入細胞核內并激活對細胞分裂和生長至關重要的c-Myc和Cyclin D1并最終誘導細胞增殖生長。因此，β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的異常表達通常與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關，而這些關鍵蛋白也常被用作藥物靶點來篩選可用于癌癥治療的小分子。在骨肉瘤中，FOXO1轉錄因子可以通過降低β-catenin的表達抑制人骨肉瘤細胞的活性進而阻止腫瘤的生長[11]。c-Myc作為一種多效性轉錄因子也已被證明在人骨肉瘤細胞中可以通過激活MEK-ERK通路促進癌細胞的遷移侵襲[12]。Cyclin D1是細胞周期進程的中心調節器，相比較正常細胞，Cyclin D1在人骨肉瘤細胞中的表達水平升高，并且過表達Cyclin D1可以有效促進人骨肉瘤細胞的生長[13]。除上述3種Wnt/β-catenin通路相關蛋白外，本研究還檢測了LRP5的表達情況。LRP5是一種具有單次跨膜蛋白結構的低密度脂蛋白受體相關蛋白，同時也是Wnt/β-catenin通路介導的信號傳導的共受體。臨床研究已證實LRP5在骨肉瘤臨床樣本中表達升高，且LRP5的表達與骨肉瘤患者的不良預后呈正相關，提示了LRP5可作為診斷骨肉瘤進展的潛在生物標志物[14]。同時組織蛋白酶家族與Wnt/β-catenin通路的調控密切相關。例如，Basu et al[15]已報道了Cat D過表達通過增強Wnt/β-catenin通路促進了直腸癌細胞的過度增殖和轉移。在本研究中，敲低Cat S基因可以下調LRP5、β-catenin、C-myc和Cyclin D1的表達，提示了Cat S低表達可能通過抑制Wnt/β-catenin通路參與了人骨肉瘤細胞的生長的過程。

綜上所述，本研究表明Cat S在人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63中呈高表達。敲低Cat S基因可以通過下調Wnt/β-catenin通路來抑制人骨肉瘤細胞SAOS2和MG63的增殖、遷移和侵襲并誘導凋亡。這些結果已經初步表明了Cat S可能是骨肉瘤分子靶向治療的潛在靶點。后續研究將會通過加入Wnt/β-catenin通路激活劑來進一步驗證Cat S對人骨肉瘤細胞增殖生長的調控作用，同時有關Cat S在骨肉瘤中的體內和臨床研究也將一并展開。