利用活細胞工作站構建巨噬細胞吞噬子宮內膜癌細胞的體外模型

檀學文，陳維樂，陳義昭，方亦龍，蔣海峰，許 振，涂佳杰，魏 偉

巨噬細胞是固有免疫系統中的重要細胞，與腫瘤發病密切相關[1-2]。活細胞工作站及其自帶的培養系統，能模擬活細胞的生活環境，是一種體外研究細胞行為的重要方法[3-5]。目前流式細胞術被廣泛用于檢測最終的細胞吞噬比例，但不能體現動態吞噬過程[6]。巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的過程是腫瘤微環境中一種復雜的相互作用[7]，利用活細胞工作站直接記錄巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的動態過程有助于進一步研究這一復雜過程，并且能夠繼續探討巨噬細胞吞噬腫瘤細胞后對CD8+IFNγ+細胞毒性T細胞激活的影響。該研究利用活細胞工作站，建立了巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的體外模型，這為深入研究巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的動態過程提供了一種可靠的實驗方法，同時研究巨噬細胞吞噬腫瘤細胞后增強T細胞的抗原提呈作用，證實其能活化細胞毒性T細胞對腫瘤的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株人源單核細胞系THP-1和人源子宮內膜癌細胞系Ishikawa購自武漢普諾賽公司。

1.2 試劑與儀器DMEM無酚紅高糖培養基、RPMI 1640培養基、MEM培養基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清購自以色列BI公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液購自上海碧云天生物技術有限公司；非必需氨基酸購自美國Gibco公司；熒光染料CFSE購自上海貝博生物科技有限公司；Brilliant Violet 421 anti-human CD11b、Brilliant Violet 421 anti-human CD8、PE/Cy7 anti-human IFNγ、PE anti-human CD3購自美國Biolegend公司；ProLongTMLive Antifade Reagent購自美國ThermoFisher公司；人源淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術有限公司；玻璃底成像皿購自北京蘭杰柯科技有限公司；徠卡活細胞工作站DMi8購自德國Leica公司；SIGMA 3-30 K低溫高速離心機購自上海納騰儀器有限公司；流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.3 細胞培養THP-1細胞培養于RPMI 1640培養基中，另補加10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素，Ishikawa細胞培養于MEM培養基中，另補加5%胎牛血清、1%的青-鏈霉素和1%非必需氨基酸置于37 ℃，5% CO2的培養箱中常規培養。當細胞密度長至80%左右時開始后續實驗。

1.4 活細胞工作站細胞樣本制備以5×105個/ml的密度將THP-1細胞接種于12孔板中，每孔1 ml完全培養基和100 ng/ml佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，處理48 h后換成普通完全培養基繼續培養24 h。THP-1預處理72 h后用0.25%胰蛋白酶消化制備成細胞懸液，再用PBS洗滌細胞2次后加入100 μl PBS重懸，在4 ℃條件下用抗人CD11b孵育巨噬細胞30 min，PBS洗滌后用500 μl不含酚紅DMEM完全培養基重懸。將細胞密度1.5×105個/ml Ishikawa細胞從培養瓶中消化并用含CFSE熒光探針的染色工作液重懸，在37 ℃培養箱孵育20 min后離心收集細胞，PBS洗滌細胞2次后用500 μl不含酚紅DMEM完全培養基重懸備用。將上述處理的CD11b標記THP-1細胞與CFSE標記Ishikawa細胞在37 ℃、5% CO2濕潤環境按約3︰1的比例混合接種在玻璃底成像皿中。

1.5 成像觀察預先開啟活細胞工作站自帶微型培養箱保持37 ℃、5% CO2的細胞培養環境，設置活細胞工作站成像系統拍攝參數：激發光強度為3，綠色熒光曝光時間為100 ms，藍色熒光曝光時間為30 ms，FIM為50%，IL-FId為6。將接種2種細胞的玻璃底成像皿放置37 ℃、5% CO2的微型培養箱中，在活細胞工作站成像系統下，每5 min拍攝一張照片，拍攝120 min，挑選巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞的代表圖。

1.6 流式細胞術檢測CD8+IFNγ+T細胞THP-1誘導的巨噬細胞與Ishikawa細胞混合共培養24 h后，加入人外周血PBMC繼續共培養24 h，流式細胞術檢測CD3+CD8+IFNγ+T細胞數量。

1.7 統計學處理采用GraphPad Prism 8.2.1軟件進行統計分析和作圖，結果以均數±標準誤差(Mean±SEM)表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THP-1誘導的巨噬細胞和Ishikawa細胞的熒光標記THP-1給予PMA誘導的巨噬細胞和Ishikawa細胞分別用Brilliant Violet 421-CD11b和CFSE熒光探針進行標記，其中藍色熒光標記的是THP-1誘導的巨噬細胞，綠色熒光標記的是Ishikawa細胞。見圖1。

圖1 THP-1誘導的巨噬細胞和Ishikawa細胞的熒光標記圖

2.2 活細胞工作站記錄THP-1誘導的巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞的過程活細胞工作站實時拍照記錄巨噬細胞對Ishikawa細胞的逐步吞噬情況，在120 min內每隔5 min拍攝一張照片，記錄巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞的過程并整理出每隔15 min的全視野細胞吞噬圖像(圖2A)。在整個視野中均可以觀察到THP-1誘導的巨噬細胞圍繞Ishikawa細胞不停運動，并隨著共培養時間的增加，巨噬細胞逐漸吞噬Ishikawa細胞。活細胞工作站拍攝的照片記錄著整個拍攝視野中的不同位置，每個位置上均勻分布著巨噬細胞和Ishikawa細胞，巨噬細胞識別周圍的Ishikawa細胞，不斷攝取Ishikawa細胞的綠色熒光，Ishikawa細胞的綠色熒光逐漸到被巨噬細胞的藍色熒光包裹，形成藍色熒光環繞綠色熒光的類似同心圓結構。在圖2B、C中，可以清楚呈現出巨噬細胞對Ishikawa細胞的吞噬現象。在共培養的不同時間點，可見到巨噬細胞開始吞噬Ishikawa細胞。圖2B中，巨噬細胞對Ishikawa細胞的吞噬作用發生在共培養40 min，巨噬細胞開始逐步攝取Ishikawa細胞的綠色熒光。圖2C展現了巨噬細胞在80 min時開始吞噬Ishikawa細胞。隨著吞噬作用的不斷進行，Ishikawa細胞的綠色熒光逐漸減弱，與0 min比較，120 min后綠色熒光減弱，差異有統計學意義(t=5.692,P<0.05)，結果見圖2D。

圖2 THP-1誘導的巨噬細胞吞噬人子宮內膜癌Ishikawa細胞示意圖

2.3 巨噬細胞對多個Ishikawa細胞的吞噬情況在巨噬細胞和Ishikawa細胞同培養0 min時，活細胞工作站記錄Ishikawa細胞和巨噬細胞呈現獨立分布。與Ishikawa細胞比較，巨噬細胞的比例更高，巨噬細胞均勻分布在Ishikawa細胞周圍。巨噬細胞吞噬單個Ishikawa細胞后，遷移到另一個Ishikawa細胞旁，不斷攝取其綠色熒光直至綠色熒光被巨噬細胞的藍色熒光完全包裹。在40 min時，吞噬了Ishikawa細胞的巨噬細胞開始包圍攝取另一個Ishikawa細胞的綠色熒光，并在80 min時完全包裹Ishikawa細胞，表明隨著共培養時間的延長，單個巨噬細胞能夠吞噬多個Ishikawa細胞。見圖3。

圖3 巨噬細胞吞噬多個Ishikawa細胞的示意圖 ×25

2.4 流式細胞術檢測巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞后對T細胞的影響為了觀察巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞后對T細胞的作用，利用流式細胞術檢測T細胞比例。與未吞噬Ishikawa細胞的巨噬細胞與PBMC共培養組比較，吞噬了Ishikawa細胞的巨噬細胞與PBMC共培養組中CD3+CD8+IFNγ+T細胞數量顯著增加，差異有統計學意義(t=9.876,P<0.05)，表明巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞后促進CD3+T細胞轉變為CD8+IFNγ+細胞毒性T細胞，增強T細胞對Ishikawa細胞的殺傷作用。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞后對T細胞的影響

3 討論

巨噬細胞是人體免疫系統的重要細胞，能夠攝取并且清除腫瘤細胞[8-9]，同時T細胞能夠識別巨噬細胞提呈的腫瘤抗原信息，殺傷腫瘤細胞[10]。本研究選擇THP-1誘導的巨噬細胞和子宮內膜癌Ishikawa細胞進行共培養，運用活細胞工作站構建了體外巨噬細胞對Ishikawa細胞的吞噬模型，為研究巨噬細胞對腫瘤細胞的動態吞噬過程提供一種新的方法。同時觀察巨噬細胞吞噬Ishikawa細胞的后續過程，實驗結果證實CD8+IFNγ+細胞毒性T細胞被進一步活化。

長時間觀察巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的復雜動態過程，這是既往使用的流式細胞術和普通熒光顯微鏡無法實現的，但是活細胞工作站能夠實現。從實驗結果可以看出，使用活細胞工作站觀察巨噬細胞吞噬腫瘤細胞有幾個比較重要的條件：① 活細胞工作站必須配有微型培養箱，保證細胞在成像觀察過程中保持正常的健康狀態；② 用100 ng/ml PMA將THP-1誘導成具有強大吞噬能力的巨噬細胞；③ 對巨噬細胞和腫瘤細胞進行不同的熒光標記，以便在動態過程中區分兩種不同的細胞，本研究使用Brilliant Violet 421-CD11b和CFSE熒光探針，分別標記THP-1誘導的巨噬細胞和Ishikawa細胞，其中CD11b標記巨噬細胞膜表面，在吞噬過程中能夠明顯觀察到Ishikawa細胞的綠色熒光被攝取到巨噬細胞胞質內。

觀察時間過長可能因為光漂白導致熒光逐漸淬滅，影響成像質量，這是活細胞成像重要的局限性。在本研究中為了減少熒光淬滅，將成像系統的參數進行調整，降低激發光強度，調整FIM為50%，并使用活細胞抗熒光淬滅劑，結果在成像過程中減少了熒光淬滅。

綜上所述，活細胞工作站能夠實時記錄巨噬細胞吞噬腫瘤細胞，長時間動態觀察細胞吞噬過程，彌補經典流式細胞術和熒光顯微鏡的不足，為巨噬細胞與腫瘤細胞相互作用研究提供了一種可行的實驗方法。在此基礎上，通過流式證明了巨噬細胞吞噬腫瘤細胞后能夠增加CD8+IFNγ+細胞毒性T細胞的比例，發揮T細胞的抗腫瘤作用。本研究中所演示的腫瘤細胞-巨噬細胞-T細胞3種細胞的相互作用模型為體外水平研究腫瘤免疫治療作用及相關潛在靶點開發提供了一個的理想平臺。