基于TLR4/NF-κB 信號通路探討鹽酸班布特羅干預COPD 模型大鼠血管重塑的機制研究

鄭春晨 佘暉

COPD 是一種常見的可防可治的疾病,主要特征為不完全可逆的氣流受限,氣流受限主要與肺部對香煙煙霧等有害氣體或顆粒引起的慢性炎癥,進而引起氣道、血管、肺實質等結構和功能異常相關。眾多國內外相關研究表明：COPD 的主要病理改變為血管重塑,其進行性加重會導致肺動脈高壓,進而發展為肺源性心臟病(肺心病),最后導致死亡。及時有效的干預血管重塑是阻止COPD 病情進展的重要步驟［1,2］。β2-受體激動劑(班布特羅)用于哮喘、COPD 治療歷史悠久,越來越多的研究證明,其除了支氣管舒張作用,β2-受體激動劑對氣道慢性炎癥具有一定的抑制作用［3,4］。本實驗探討鹽酸班布特羅改善COPD 模型大鼠癥狀的一般情況,探討其與血清VEGF、ET-1、CTGF 含量水平的相關性,進而探討其是否干預COPD血管重塑。現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取浙江省維通利華實驗動物技術有限公司提供的SPF 級雄性 SD 大鼠 30 只,8 周齡,質量(200±20) g,環境溫度 24～26℃,濕度50%。

1.2實驗試劑 脂多糖(批號：L8274,Sigma 公司,026︰B6)；鹽酸班布特羅(阿斯利康制藥有限公司,國藥準字H19990072,規格：10 mg/片)；天下秀香煙(四川中煙工業有限責任公司)；大鼠血清VEGF、大鼠血清ET-1、大鼠CTGF 酶聯免疫吸附試劑盒(購買于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；TLR4/NF-κB 免疫組化試劑盒(購買于武漢賽維爾生物有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1制作COPD 模型 將30 只SD 大鼠于動物房適應性飼養7 d 后,隨機分為空白對照組、模型組和給藥組,每組10 只。模型組、給藥組采用目前國內外公認的煙熏聯合LPS 法建立 COPD 大鼠模型：造模周期為42 d,將大鼠每天定時在自制煙熏箱內用香煙煙熏,而在第1、14 天時用水合氯醛麻醉,氣管內滴注1 mg/ml LPS 溶液0.2 ml。空白對照組大鼠不煙熏,氣道內滴注等體積生理鹽水代替。COPD 造模成功與否主要觀察肺血管的病理變化情況。

1.3.2藥物干預 造模成功后,模型組和給藥組大鼠繼續適當煙熏保持模型,同時給藥組大鼠給予鹽酸班布特羅灌胃,1 次/d,連續給藥45 d；空白對照組和模型組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃。

1.3.3標本采集 所有大鼠于實驗第88 天標本采集(42 天造模,45 天結藥)。用水合氯醛充分麻醉,開胸后進行心臟取血,血液室溫靜置2 h 后,以4℃、3000 r/min 條件離心10 min,取上清液,保存于-20℃冰箱備用。同時分離出雙肺,用生理鹽水多次漂洗后用4%多聚甲醛進行固定,后續石蠟包埋、切片。

1.3.4ELISA 檢測大鼠VEGF、ET-1、CTGF表達按照ELISA 試劑盒說明書操作分別測定各組大鼠VEGF、CTGF、ET-1 表達情況。

1.3.5免疫組化測定TLR4/NF-κB 蛋白表達 將切片脫蠟水化,雙氧水封閉,抗原修復后,按照試劑盒說明書滴加TLR4/NF-kB 的一抗、二抗,蘇木素復染,脫水,封片。同時使用武漢賽維爾圖像分析系統自動分析玻片內弱中強陽性細胞數,根據切片情況對陽性細胞數進行評價。

1.4觀察指標 觀察三組大鼠COPD 模型建立后肺組織HE 染色情況；比較三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達水平及血清VEGF、ET-1、CTGF 表達水平。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差()表示,多組間比較采用F 檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1三組大鼠COPD 模型建立后肺組織HE 染色情況空白對照組肺組織：肺泡結構完整,無炎癥細胞浸潤,肺血管壁正常；模型組肺組織：肺泡壁斷裂,肺泡壁融合肺大泡形成,肺血管壁明顯增厚,大量炎癥細胞浸潤,符合COPD 大鼠肺組織病理改變；給藥組肺組織：肺泡壁部分斷裂,肺泡壁部分融合成為肺大泡,肺泡血管壁稍增厚,肺部炎癥細胞雖有浸潤,但較模型組明顯減少。見圖1,圖2,圖3。

圖1 空白對照組肺組織HE 染色×200

圖2 模型組肺組織HE 染色×200

圖3 給藥組肺組織HE 染色×200

2.2三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達水平比較模型組和給藥組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達水平均高于空白對照組,模型組高于給藥組,三組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1,圖4,圖5,圖6,圖7,圖8,圖9。

圖4 空白對照組NF-κB 表達情況×200

圖5 模型組NF-κB 表達情況×200

圖6 給藥組NF-κB 表達情況×200

圖7 空白對照組TLR4 表達情況×200

圖8 模型組TLR4 表達情況×200

圖9 給藥組TLR4 表達情況×200

表1 三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達水平比較()

表1 三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達水平比較()

注：三組比較,P<0.05

2.3三組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達水平比較 模型組和給藥組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達水平均高于空白對照組,模型組高于給藥組,三組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達水平比較()

表2 三組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達水平比較()

注：三組比較,P<0.05

3 討論

目前COPD 的病因仍不十分明確,但已知血管重塑是其非常重要的病理改變,血管重塑與煙霧、職業粉塵、化學物質、感染、慢性缺氧所形成的諸多細胞因子表達異常相關［5,6］。據國內外研究顯示,VEGF 與COPD 的肺血管重構密切相關,VEGF 是最強的血管生成激活因子,它可以刺激現有血管內皮細胞的遷移和增殖,產生和穩定新的血管［7］。ET-1 是內皮細胞合成并分泌的收縮血管的多肽,在各種缺氧及炎癥反應的刺激下,肺微小動脈出現內皮損傷,導致ET-1 和一氧化氮失衡,引起持續的肺血管收縮,肺循環阻力增高,產生肺動脈高壓；同時會提高血管平滑肌的增殖速度,肺血管壁增厚,管腔狹窄或閉塞［8］。CTGF 是一種有效的血管生成因子,促進成纖維細胞增殖及細胞外基質的產生,參與COPD 氣道重構和血管重構的發生發展［9］。大鼠的VEGF、ET-1、CTGF 表達上調與肺的慢性炎癥相關,是目前評估血管重塑的重要指標。

TLR4/NF-κB 信號通路在COPD 血管重塑病變中發揮重要作用。TLR4 與各種內源性和外源性配體結合,通過MyD88 依賴性途徑和MyD88 非依賴性途徑激活TLR4/NF-κB 通路,產生各種炎癥因子,從而導致血管內皮細胞損傷以及血管平滑肌細胞增生、遷移［10,11］。腎上腺素β2-受體激動劑用于哮喘、COPD 治療歷史悠久,傳統上只注意到其對支氣管平滑肌的舒張作用,近年來越來越多的研究證明,β2-受體激動劑對氣道慢性炎癥具有一定的抑制作用,并對其作用機制做了許多研究［12］。Farmer 等［3］研究發現β2-受體激動劑明顯抑制κB (NF-κB 抑制分子)降解,從而抑制 NF-κB 活化,而且這一作用可被β2-受體阻斷劑所拮抗。張志大等［13］的研究也表明班布特羅能夠下調NF-κB 活性及調控因子等炎癥因子,從而減輕氣道炎癥。

本實驗以煙熏法聯合LPS 制作COPD 模型大鼠。結果顯示：模型組和給藥組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達水平均高于空白對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。模型組和給藥組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達水平均高于空白對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。與文獻報道一致［14,15］。這提示可能TLR4 與相應配體結合通過激活NF-κB 信號通路起到促炎作用,導致異常血管增生、肺動脈平滑肌合成異常。與模型組對比,給藥組的TLR4、NF-κB、VEGF、ET-1、CTGF 的表達有所降低。推測鹽酸班布特羅可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路降低氣道慢性炎癥,減輕血管重塑,從而使血管平滑肌增生得到改善。

綜上所述,鹽酸班布特羅可能有效抑制 COPD 血管重塑,其機制可能為班布特羅抑制受體TLR4 表達,降低配體 LPS 和煙霧對TLR4/NF-κB 信號通路的誘導作用,下調血管平滑肌增生相關因子VEGF、ET-1、CTGF 的合成與分泌,從而延緩或阻滯COPD 血管重塑的過程,但具體機制仍不十分明確,仍需做進一步探討。