基于TLR4/NF-κB 信號(hào)通路探討鹽酸班布特羅干預(yù)COPD 模型大鼠血管重塑的機(jī)制研究

鄭春晨 佘暉

COPD 是一種常見的可防可治的疾病,主要特征為不完全可逆的氣流受限,氣流受限主要與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或顆粒引起的慢性炎癥,進(jìn)而引起氣道、血管、肺實(shí)質(zhì)等結(jié)構(gòu)和功能異常相關(guān)。眾多國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明：COPD 的主要病理改變?yōu)檠苤厮?其進(jìn)行性加重會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓,進(jìn)而發(fā)展為肺源性心臟病(肺心病),最后導(dǎo)致死亡。及時(shí)有效的干預(yù)血管重塑是阻止COPD 病情進(jìn)展的重要步驟［1,2］。β2-受體激動(dòng)劑(班布特羅)用于哮喘、COPD 治療歷史悠久,越來(lái)越多的研究證明,其除了支氣管舒張作用,β2-受體激動(dòng)劑對(duì)氣道慢性炎癥具有一定的抑制作用［3,4］。本實(shí)驗(yàn)探討鹽酸班布特羅改善COPD 模型大鼠癥狀的一般情況,探討其與血清VEGF、ET-1、CTGF 含量水平的相關(guān)性,進(jìn)而探討其是否干預(yù)COPD血管重塑。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取浙江省維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 30 只,8 周齡,質(zhì)量(200±20) g,環(huán)境溫度 24～26℃,濕度50%。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖(批號(hào)：L8274,Sigma 公司,026︰B6)；鹽酸班布特羅(阿斯利康制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H19990072,規(guī)格：10 mg/片)；天下秀香煙(四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)；大鼠血清VEGF、大鼠血清ET-1、大鼠CTGF 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(購(gòu)買于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；TLR4/NF-κB 免疫組化試劑盒(購(gòu)買于武漢賽維爾生物有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1制作COPD 模型 將30 只SD 大鼠于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組和給藥組,每組10 只。模型組、給藥組采用目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的煙熏聯(lián)合LPS 法建立 COPD 大鼠模型：造模周期為42 d,將大鼠每天定時(shí)在自制煙熏箱內(nèi)用香煙煙熏,而在第1、14 天時(shí)用水合氯醛麻醉,氣管內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 溶液0.2 ml。空白對(duì)照組大鼠不煙熏,氣道內(nèi)滴注等體積生理鹽水代替。COPD 造模成功與否主要觀察肺血管的病理變化情況。

1.3.2藥物干預(yù) 造模成功后,模型組和給藥組大鼠繼續(xù)適當(dāng)煙熏保持模型,同時(shí)給藥組大鼠給予鹽酸班布特羅灌胃,1 次/d,連續(xù)給藥45 d；空白對(duì)照組和模型組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃。

1.3.3標(biāo)本采集 所有大鼠于實(shí)驗(yàn)第88 天標(biāo)本采集(42 天造模,45 天結(jié)藥)。用水合氯醛充分麻醉,開胸后進(jìn)行心臟取血,血液室溫靜置2 h 后,以4℃、3000 r/min 條件離心10 min,取上清液,保存于-20℃冰箱備用。同時(shí)分離出雙肺,用生理鹽水多次漂洗后用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,后續(xù)石蠟包埋、切片。

1.3.4ELISA 檢測(cè)大鼠VEGF、ET-1、CTGF表達(dá)按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作分別測(cè)定各組大鼠VEGF、CTGF、ET-1 表達(dá)情況。

1.3.5免疫組化測(cè)定TLR4/NF-κB 蛋白表達(dá) 將切片脫蠟水化,雙氧水封閉,抗原修復(fù)后,按照試劑盒說(shuō)明書滴加TLR4/NF-kB 的一抗、二抗,蘇木素復(fù)染,脫水,封片。同時(shí)使用武漢賽維爾圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)分析玻片內(nèi)弱中強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),根據(jù)切片情況對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4觀察指標(biāo) 觀察三組大鼠COPD 模型建立后肺組織HE 染色情況；比較三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達(dá)水平及血清VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用F 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠COPD 模型建立后肺組織HE 染色情況空白對(duì)照組肺組織：肺泡結(jié)構(gòu)完整,無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺血管壁正常；模型組肺組織：肺泡壁斷裂,肺泡壁融合肺大泡形成,肺血管壁明顯增厚,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),符合COPD 大鼠肺組織病理改變；給藥組肺組織：肺泡壁部分?jǐn)嗔?肺泡壁部分融合成為肺大泡,肺泡血管壁稍增厚,肺部炎癥細(xì)胞雖有浸潤(rùn),但較模型組明顯減少。見圖1,圖2,圖3。

圖1 空白對(duì)照組肺組織HE 染色×200

圖2 模型組肺組織HE 染色×200

圖3 給藥組肺組織HE 染色×200

2.2三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達(dá)水平比較模型組和給藥組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組,模型組高于給藥組,三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖4,圖5,圖6,圖7,圖8,圖9。

圖4 空白對(duì)照組NF-κB 表達(dá)情況×200

圖5 模型組NF-κB 表達(dá)情況×200

圖6 給藥組NF-κB 表達(dá)情況×200

圖7 空白對(duì)照組TLR4 表達(dá)情況×200

圖8 模型組TLR4 表達(dá)情況×200

圖9 給藥組TLR4 表達(dá)情況×200

表1 三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達(dá)水平比較()

表1 三組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達(dá)水平比較()

注：三組比較,P<0.05

2.3三組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)水平比較 模型組和給藥組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組,模型組高于給藥組,三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)水平比較()

表2 三組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)水平比較()

注：三組比較,P<0.05

3 討論

目前COPD 的病因仍不十分明確,但已知血管重塑是其非常重要的病理改變,血管重塑與煙霧、職業(yè)粉塵、化學(xué)物質(zhì)、感染、慢性缺氧所形成的諸多細(xì)胞因子表達(dá)異常相關(guān)［5,6］。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究顯示,VEGF 與COPD 的肺血管重構(gòu)密切相關(guān),VEGF 是最強(qiáng)的血管生成激活因子,它可以刺激現(xiàn)有血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖,產(chǎn)生和穩(wěn)定新的血管［7］。ET-1 是內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的收縮血管的多肽,在各種缺氧及炎癥反應(yīng)的刺激下,肺微小動(dòng)脈出現(xiàn)內(nèi)皮損傷,導(dǎo)致ET-1 和一氧化氮失衡,引起持續(xù)的肺血管收縮,肺循環(huán)阻力增高,產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓；同時(shí)會(huì)提高血管平滑肌的增殖速度,肺血管壁增厚,管腔狹窄或閉塞［8］。CTGF 是一種有效的血管生成因子,促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,參與COPD 氣道重構(gòu)和血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展［9］。大鼠的VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)上調(diào)與肺的慢性炎癥相關(guān),是目前評(píng)估血管重塑的重要指標(biāo)。

TLR4/NF-κB 信號(hào)通路在COPD 血管重塑病變中發(fā)揮重要作用。TLR4 與各種內(nèi)源性和外源性配體結(jié)合,通過(guò)MyD88 依賴性途徑和MyD88 非依賴性途徑激活TLR4/NF-κB 通路,產(chǎn)生各種炎癥因子,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移［10,11］。腎上腺素β2-受體激動(dòng)劑用于哮喘、COPD 治療歷史悠久,傳統(tǒng)上只注意到其對(duì)支氣管平滑肌的舒張作用,近年來(lái)越來(lái)越多的研究證明,β2-受體激動(dòng)劑對(duì)氣道慢性炎癥具有一定的抑制作用,并對(duì)其作用機(jī)制做了許多研究［12］。Farmer 等［3］研究發(fā)現(xiàn)β2-受體激動(dòng)劑明顯抑制κB (NF-κB 抑制分子)降解,從而抑制 NF-κB 活化,而且這一作用可被β2-受體阻斷劑所拮抗。張志大等［13］的研究也表明班布特羅能夠下調(diào)NF-κB 活性及調(diào)控因子等炎癥因子,從而減輕氣道炎癥。

本實(shí)驗(yàn)以煙熏法聯(lián)合LPS 制作COPD 模型大鼠。結(jié)果顯示：模型組和給藥組大鼠肺血管TLR4、NF-κB 表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組和給藥組大鼠血清VEGF、ET-1、CTGF 表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14,15］。這提示可能TLR4 與相應(yīng)配體結(jié)合通過(guò)激活NF-κB 信號(hào)通路起到促炎作用,導(dǎo)致異常血管增生、肺動(dòng)脈平滑肌合成異常。與模型組對(duì)比,給藥組的TLR4、NF-κB、VEGF、ET-1、CTGF 的表達(dá)有所降低。推測(cè)鹽酸班布特羅可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路降低氣道慢性炎癥,減輕血管重塑,從而使血管平滑肌增生得到改善。

綜上所述,鹽酸班布特羅可能有效抑制 COPD 血管重塑,其機(jī)制可能為班布特羅抑制受體TLR4 表達(dá),降低配體 LPS 和煙霧對(duì)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的誘導(dǎo)作用,下調(diào)血管平滑肌增生相關(guān)因子VEGF、ET-1、CTGF 的合成與分泌,從而延緩或阻滯COPD 血管重塑的過(guò)程,但具體機(jī)制仍不十分明確,仍需做進(jìn)一步探討。