Nrf2調控小膠質細胞功能轉化在腦出血后血腫清除中的作用機制*

包霜謹，劉麗榮，要振佳，柏琴琴，梁春甜，符鵬程，劉祥玉，王改青

[1.山西醫科大學基礎醫學院，山西太原 030001；2.山西醫科大學第二臨床醫學院神經內科，山西太原 030001；3.深圳龍華區中心醫院神經內科，廣東深圳 518110；4.海南醫學院附屬三亞中心醫院神經內科，海南三亞572000]

腦出血的發病率和病死率高，血腫及其降解產物是導致腦出血預后不良的主要原因[1]。研究[2]表明，小膠質細胞可通過調節炎癥反應參與腦出血后的血腫清除。腦出血后激活的小膠質細胞分為促炎和抗炎兩種狀態[3]。促炎表型以產生腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、CD80、CD86 等為特征，誘導神經細胞死亡，促進神經炎癥。而白細胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）、白細胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和CD206 等抗炎分子的分泌代表小膠質細胞的吞噬功能，可減輕炎癥，促進神經功能的修復[4]。除此之外，髓樣細胞上表達的I型受體（recombinant human triggering receptor expressed on myeloid cells 1, Trem1）是小膠質細胞重要的炎癥放大因子[5-6]，而髓樣細胞上表達的Ⅱ型受體（recombinant human triggering receptor expressed on myeloid cells 2, Trem2）具有吞噬、抗炎和神經保護作用[7-8]。 核因子紅系相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）作為調節因子在清除內源性血腫中的作用引起了廣泛的關注[1]。本團隊前期研究證實了Nrf2 激動劑紅曲素能促進腦出血后血腫的清除并發揮神經保護作用[9-10]，并且發現通過抑制Trem1可改善蛛網膜下腔出血患者的神經功能缺損和腦水腫[11]。Nrf2 是否通過影響小膠質細胞的功能轉化發揮血腫清除的作用目前尚不明確。本研究通過探討Nrf2 對小膠質細胞功能的影響，進一步從細胞水平探究腦出血后Nrf2 在血腫清除中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物實驗嚴格遵守山西醫科大學倫理委員會的各項規定。雄性C57BL/6 小鼠34 只，4～5 周齡，體重（20±2）g，購自山西醫科大學動物中心[實驗動物生產許可證號：SCXK（晉）2019-004，實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2019-007]。雄性Nrf2 基因敲除小鼠（Nrf2 knockout mice, Nrf2-/-）C57BL/6 小鼠8 只，4～5 周齡，體重（20±1）g，購自Cyagen模型生物學研究中心（太倉）有限公司（中國蘇州）[實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-003，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-005]。均在適宜的濕度及溫度條件下飼養，保證自由飲水及攝食。

1.2 藥物、試劑及儀器

賽拉嗪（上海麥克林生化科技有限公司，規格：1 g），氯胺酮（福建古田藥業有限公司，規格：1 g），Ⅳ型膠原酶（上海索萊寶生物科技有限公司），紅曲素（上海子起生物科技有限公司，產品批號：55WXQ-XC60，規格：1 g），血脂康（北大維信公司，國藥準字：Z10950029，規格：1 g）。生理鹽水（江西科達衛生用品有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）、RIPA 緩沖液、牛血清白蛋白、BCA 試劑盒、SDS 聚丙烯酰胺凝膠（武漢博士德生物工程有限公司），文齊式液（上海信帆生物科技有限公司），4%多聚甲醛（上海源葉生物有限公司），蔗糖緩沖液（PBS配置，天津科密歐化學試劑有限公司），倉鼠抗CD80、兔抗CD206、山羊抗小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白（ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1）、兔抗Nrf2、大鼠抗Trem2、兔抗Trem1、兔抗TNF-α、兔抗BDNF、β-actin（美國Abcam 公司），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）標記兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）、CY3-兔抗大鼠IgG（H+L）（武漢博士德生物工程有限公司），山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 647）、山羊抗倉鼠IgG H&L（FITC）（美國Abcam 公司），含4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI）的防淬滅封片劑、ECL 發光液（上海索萊寶生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（美國Millipore 公司）。立體定位儀、顱骨鉆（北京眾實迪創科技發展有限責任公司），微量注射器（上海高鴿工貿有限公司），骨蠟（上海強生醫療器材有限公司），分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），冷凍切片機（德國Leica 公司），烘箱（上海合恒儀器設備有限公司），TS2R 熒光顯微鏡（日本尼康公司），搖床（上海赫田科學儀器有限公司）。

1.3 模型復制

腹腔注射賽拉嗪10 mg/kg 和氯胺酮100 mg/kg麻醉小鼠，以俯臥位固定于立體定位儀，對實驗區域的皮膚進行消毒、備皮后，沿頭皮正中做一縱行切口，剔除骨膜，暴露前囟，通過坐標（前囟后0.9 mm，中線外側1.5 mm，深度3.5 mm）定位小鼠右側基底節區，用顱骨鉆做一孔徑約1 mm 的小孔，采用微量注射器抽取0.3 u Ⅳ型膠原酶注射至小鼠的右側基底節區，然后固定于立體定位儀上，調節定位儀使其針頭經小孔進針3.5 mm，針頭在此位置保持15 min 不動，然后退針，用骨蠟封閉小孔，最后縫皮。

1.4 神經功能評估

待模型小鼠清醒后，采用改良Garcia 評分評估神經功能[12-13]。修改后的量表包含6 項獨立測試，分別是自主運動、體態對稱性、前肢伸展運動、抓持和攀爬鐵籠的能力、兩側身體觸覺反射及兩側胡須碰觸反應。每項測試0～3 分，總分18 分，分數越高，神經功能缺損的程度越重。

1.5 分組

隨機將C57BL/6 小鼠分為對照組（n=8）、腦出血組（n=9）、腦出血+紅曲素組（n=8）、腦出血+血脂康組（n=9）；Nrf2-/-C57BL/6 小鼠為腦出血+Nrf2-/-組（n=8）。對照組以生理鹽水代替Ⅳ型膠原酶完成手術，術后給予生理鹽水灌胃，1 次/d；腦出血組術后給予生理鹽水灌胃1 次/d；腦出血+紅曲素組術后給予紅曲素10 mg/（kg·d），2 次/d；腦出血+血脂康組術后給予血脂康0.2 g/（kg·d），2 次/d；腦出血+Nrf2-/-組術后給予生理鹽水灌胃，1 次/d。腦出血+血脂康組和腦出血+紅曲素組小鼠在術后6 h 灌胃給藥，直至實驗設定的時間點。本實驗中采用的給藥途徑、方法及取腦的時間點選擇均基于本課題組的前期研究；前期本課題組觀察Nrf2 的時間點，已表明在腦出血后的72 h，血腫周圍的血紅蛋白含量、腦水含量及水腫體積均達到峰值，神經功能缺損嚴重，10 mg/（kg·d）紅曲素組的Nrf2 陽性細胞最多[10，12-13]。本研究在前期研究基礎上，選擇腦出血后的72 h 作為時間點，探究Nrf2 在腦出血后血腫清除中的作用機制。

1.6 血紅蛋白水平測定

腹腔麻醉后打開小鼠的胸腔，用預冷的PBS 進行心臟灌注，待流出的液體清亮時停止灌注。斷頭取腦，于-80℃儲存腦組織。取血腫周圍的腦組織于1 100 μL PBS 中勻漿，4℃15 000 r/min 離心30 min 并收集上清液。按上清液∶文齊式液為1∶4比例混勻，室溫反應5 min 后，在分光光度計上測定540 nm 波長處的吸光度值。根據吸光度計算血紅蛋白水平，各組測定值的均值/手術對照組測定值的均值代表各組的平均血腫量。

1.7 免疫熒光檢測

小鼠深度麻醉后，經心臟灌注PBS 和4%多聚甲醛。斷頭取腦組織，標本浸泡在4%多聚甲醛中4℃過夜，隔日分別用20%、30%的蔗糖緩沖液4°C下脫水，直至組織完全滲透。采用冷凍切片機冠狀切片標本，厚度4 μm。將冷凍切片放至50°C 烘箱1 h 固定后，PBS 漂洗3 次，每次5 min，以1%的牛血清白蛋白封閉。封閉結束后分別按照以下比例進行一抗的過夜孵育：倉鼠抗CD80（1：200）/兔抗CD206（1∶200）、山羊抗Iba1（1∶200）/兔抗Nrf2（1∶100）、大鼠抗Trem2（1∶200）/ 山羊抗Iba1（1∶200）和兔抗Trem1（1∶100）/山羊抗Iba1（Iba1 1∶200），PBS 漂洗后，避光條件下進行熒光二抗的孵育：FITC 標記兔抗山羊IgG（1∶500），山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 647）（1∶300），山羊抗倉鼠IgG H&L（FITC）（1∶600），CY3-兔抗大鼠IgG（H+L）（1∶500）。孵育結束后，PBS 漂洗，稍晾干后在組織中央滴加含DAPI 的防淬滅封片劑封片，在TS2R 熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western blotting檢測蛋白表達

取小鼠腦血腫周圍的新鮮腦組織，在RIPA緩沖液中勻漿（含蛋白酶抑制劑），4℃下靜置并12 000 r/min 離心10 min，收集上清液后采用BCA 試劑盒進行蛋白濃度的測定。將等量的待測蛋白溶液加到SDS 聚丙烯酰胺凝膠上，待電泳后目標蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入兔抗TNF-α（1∶2 000）、兔抗BDNF（1∶1 000）、兔抗Nrf2（1∶1 000）、倉鼠抗CD80（1∶1 000）、兔抗CD206（1∶1 000）、兔抗Trem1（1∶1 000）、大鼠抗Trem2（1∶1 000）4°C 下過夜孵育，β-actin（1∶1 000）作為參照。第2 天，用PBS 清洗后孵育相應的二抗：山羊抗兔IgG 抗體（1∶5 000），山羊抗倉鼠IgG 抗體（1∶5 000），兔抗大鼠IgG（1∶5 000），室溫搖床孵育2 h，采用ECL 發光液曝光。采用Image J 軟件計算灰度值，目標蛋白的相對表達量=目標蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件和GraphPad Prism 7.0 圖形分析軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗；計數資料以構成比表示，比較用Fisher 精確概率法；相關分析用Pearson 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型復制結果

對照組、腦出血+紅曲素組、腦出血+Nrf2-/-組均存活。腦出血組因蛛網膜下腔出血死亡1 只，腦出血+血脂康組藥物干預后死亡1 只。小鼠的手術總死亡率為4.7%（2/42）。

2.2 各組小鼠改良Garcia評分及血紅蛋白水平比較

5 組小鼠的改良Garcia 評分和血紅蛋白水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，與對照組比較，腦出血組改良Garcia 評分降低（P=0.004），血紅蛋白水平升高（P＜0.05）；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的改良Garcia 評分升高（P=0.038）、血紅蛋白水平降低（P＜0.05），腦出血+血脂康組的改良Garcia 評分升高（P=0.021）、血紅蛋白水平降低（P＜0.05），腦出血+Nrf2-/-組的改良Garcia 評分降低（P＜0.05）、血紅蛋白水平升高（P=0.007）。見表1。

表1 各組小鼠改良Garcia評分及血紅蛋白水平比較（n=8，±s）

表1 各組小鼠改良Garcia評分及血紅蛋白水平比較（n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值血紅蛋白/g/L 1.015±0.008 2.492±0.058①2.725±0.133①②1.378±0.210①②1.287±0.262①②144.300 0.000改良Garcia評分17.710±0.756 14.250±1.709①6.375±2.066①②16.780±1.581①②17.000±1.309①②72.360 0.000

2.3 各組小鼠小膠質細胞Nrf2蛋白的表達

5 組小鼠Nrf2 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，與對照組比較，腦出血組Nrf2 蛋白相對表達量升高（P=0.022）；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組（P= 0.007）和腦出血+血脂康組（P=0.000）的Nrf2 蛋白相對表達量升高，腦出血+Nrf2-/-組的Nrf2 蛋白相對表達量降低（P=0.000）（見圖1和表2）。免疫熒光檢測證實Nrf2表達的相似模式（見圖2）。

圖2 各組小鼠Nrf2蛋白表達的免疫熒光圖 （×400）

表2 各組小鼠Nrf2蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

表2 各組小鼠Nrf2蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值Nrf2 0.486±0.096 0.841±0.339①0.096±0.026①②1.252±0.245①②1.478±0.169①②44.110 0.000

圖1 各組小鼠Nrf2蛋白的表達

2.4 各組小鼠小膠質細胞Trem1、Trem2蛋白的表達

5 組小鼠Trem1、Trem2 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，與對照組比較，腦出血組Trem1（P=0.000）、Trem2（P=0.001）蛋白相對表達量升高；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的Trem1 蛋白相對表達量降低（P=0.046）、Trem2 蛋白相對表達量增加（P=0.002），腦出血+血脂康組的Trem1 蛋白相對表達量降低（P=0.046）、Trem2 蛋白相對表達量增加（P=0.000），腦出血+Nrf2-/-組的Trem1 蛋白相對表達量升高（P=0.025）、Trem2 蛋白相對表達量降低（P=0.000）（見圖3和表3）。免疫熒光檢測證實了Trem1、Trem2 表達的相似模式（見圖4）。

圖3 各組小鼠Trem1、Trem2蛋白的表達

圖4 各組小鼠Trem1、Trem2蛋白表達的免疫熒光圖 （×400）

表3 各組小鼠Trem1、Trem2蛋白相對表達量比較（n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值Trem2 0.292±0.076 0.518±0.114①0.152±0.067①②0.722±0.092①②0.976±0.079①②86.940 0.000 Trem1 0.253±0.114 0.931±0.203①1.259±0.248①②0.634±0.155①②0.633±0.224①②22.310 0.000

2.5 各組小鼠小膠質細胞CD80、CD206蛋白的表達

5 組小鼠CD80、CD206 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，腦出血組CD80 和CD206 蛋白相對表達量較對照組增加（均P=0.000）；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的CD80 蛋白相對表達量降低（P=0.000）、CD206 蛋白相對表達量升高（P=0.026），腦出血+血脂康組的CD80 蛋白相對表達量降低（P=0.000）、CD206 蛋白相對表達量升高（P=0.000），腦出血+Nrf2-/-組的CD80 蛋白相對表達量升高（P=0.029）、CD206 蛋白相對表達量降低（P=0.020）（見圖5和表4）。免疫熒光檢測證實了CD80 和CD206 表達的相似模式（見圖6）。

圖6 各組小鼠CD80、CD206蛋白表達的免疫熒光圖 （×400）

表4 各組小鼠CD80、CD206蛋白相對表達量比較（n=8，±s）

表4 各組小鼠CD80、CD206蛋白相對表達量比較（n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值CD206 0.251±0.112 0.618±0.157①0.381±0.085②0.848±0.178①②1.052±0.132①②34.710 0.000 CD80 0.180±0.052 1.001±0.136①1.222±0.094①②0.600±0.218①②0.598±0.093①②56.830 0.000

圖5 各組小鼠CD80、CD206蛋白的表達

2.6 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白相對表達量比較

5 組小鼠TNF-α、BDNF 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，與對照組比較，腦出血組TNF-α（P=0.000）和BDNF（P=0.024）蛋白相對表達量均升高；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的TNF-α蛋白相對表達量降低（P=0.009）、BDNF 蛋白相對表達量升高（P=0.021），腦出血+血脂康組的TNF-α蛋白相對表達量降低（P=0.010）、BDNF 蛋白相對表達量升高（P=0.003），腦出血+Nrf2-/-組的TNF-α蛋白相對表達量升高（P=0.014）、BDNF 蛋白相對表達量降低（P=0.000）。見圖7和表5。

表5 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白相對表達量比較（n=8，±s）

表5 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白相對表達量比較（n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值BDNF 0.345±0.165 0.606±0.169①0.109±0.057①②0.873±0.158①②0.941±0.186①②31.290 0.000 TNF-α 0.280±0.121 0.979±0.151①1.334±0.330①②0.604±0.130①②0.609±0.161①②25.990 0.000

圖7 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白表達

2.7 Trem1與改良Garcia評分的相關性

小鼠腦出血后，小膠質細胞Trem1 蛋白表達與改良Garcia 評分呈負相關（r=-0.956，P=0.000），即小膠質細胞Trem1 蛋白表達越多，神經功能恢復越差。見圖8。

圖8 小膠質細胞Trem1蛋白表達與改良Garcia評分的相關性

2.8 Trem2與改良Garcia評分、血紅蛋白的相關性

小鼠腦出血后，小膠質細胞Trem2 蛋白表達與改良Garcia 評分呈正相關（r=0.936，P=0.000），與血紅蛋白呈負相關（r=-0.473，P=0.009）。即小膠質細胞Trem2 蛋白表達越多，血紅蛋白水平越低，神經功能恢復越好。見圖9、10。

圖9 小膠質細胞Trem2蛋白表達與改良Garcia評分的相關性

圖10 小膠質細胞Trem2蛋白表達與血紅蛋白的相關性

3 討論

本研究結果顯示，腦出血+紅曲素組和腦出血+血脂康組C57BL/6 小鼠的Nrf2 表達升高，腦出血+Nrf2-/-組Nrf2 的表達降低，這表明激動劑和基因敲除小鼠對Nrf2 的調控作用。紅曲素和血脂康作為Nrf2 的激動劑，可上調CD206、Trem2 及BDNF 的表達，下調CD80、Trem1 及TNF-α 的表達，而腦出血+Nrf2-/-組的結果相反，這表明Nrf2 可能促進小膠質細胞向抗炎及吞噬功能轉化。腦出血+紅曲素組和腦出血+血脂康組血紅蛋白水平降低，提示藥物能改善腦出血后小鼠神經功能缺損；而腦出血+Nrf2-/-組的結果相反，提示Nrf2 參與了腦出血后血腫的清除和神經功能的改善。Trem1 蛋白表達與改良Garcia 評分呈負相關，Trem2 蛋白表達與改良Garcia 評分呈正相關，與血紅蛋白呈負相關，提示Trem2 可能促進血腫產物的清除及改善神經功能，Trem1 加重神經功能的缺損。

小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞，被激活后會發生形態和功能上的改變。激活后的小膠質細胞啟動免疫反應，釋放的炎癥介質是神經炎癥級聯反應的重要調節因子，并且可通過改變各種表面受體來發揮抗炎或者促炎作用[14]；在小膠質細胞激活過程中存在一個自反饋級聯環路，這些炎癥信號被小膠質細胞激活的自我反饋回路放大，構建了一個免疫級聯炎癥網絡[11]。Nrf2 是廣泛存在于小膠質細胞中的多效轉錄因子。它是細胞氧化應激的穩態調節因子，具有很強的抗氧化能力，產生的抗氧化劑包括血紅素加氧酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽巰基轉移酶，最后可激活觸珠蛋白[15]。此外，Nrf2 是近年來發現的腦卒中和神經退行性疾病中調節小膠質細胞的重要靶點。Nrf2 可通過下調NF-κB 促進小膠質細胞向抗炎表型轉化[16]。

紅曲素的主要成分為紅曲霉菌在水稻中發酵而成的黃色天然色素，是一種新型的Nrf2 激動劑[16]，筆者之前的研究表明可抑制病理條件下的氧化應激，促進血腫吸收，減少腦水腫[9]。血脂康是以紅曲素為成分的中藥，以莫那霉素為主要成分的膽甾素提取物，主要用于抗動脈粥樣硬化，并通過抑制TLR4/NF-κB 發揮抗炎作用[17]。本研究結果顯示，兩者均促進了Nrf2 的表達，且差異無統計學意義。

Trem1 和Trem2 是在骨髓細胞家族上表達的觸發受體的成員，主要通過識別外來抗原和有毒物質，從而調節炎癥反應；大多數研究表明Trem1 可促進炎癥反應，而Trem2 可抑制炎癥反應[18]；在中樞神經系統中主要表達于小膠質細胞，是腦出血后炎癥的關鍵調控因子。研究表明，抑制Trem1 的表達可以減少腦出血介導的神經炎癥及減輕神經功能缺陷[19]；而激活Trem2 的表達可清除或內吞凋亡細胞及細胞碎片，減輕小鼠腦出血后的神經炎癥和神經元凋亡[20]，對神經可塑性和髓鞘形成至關重要[21]。本結果顯示腦出血組的Trem1 上調，提示Trem1 與腦出血的神經炎癥高度相關。在腦出血+Nrf2-/-組中，Trem1 表達上調，Trem2 表達下降，而Nrf2 激動劑——紅曲素和血脂康可抑制Trem1、強化Trem2 的表達，提示紅曲素和血脂康通過上調Nrf2抑制Trem1 的神經炎癥級聯反應，同時強化Trem2的表達；Trem2 作為抗炎因子可降低腦內促炎因子的表達及由Trem1 引起的神經炎癥反應，Trem2 的蛋白表達與改良Garcia 評分呈正相關，與血紅蛋白呈負相關，說明Trem2 起到神經保護作用，可能通過吞噬參與腦出血后血腫成分的清除。Trem2、BDNF 被認為是神經修復的必需物質。研究結果表明Nrf2 可直接影響Trem1/Trem2 的表達變化發揮神經保護作用。此外紅曲素和血脂康可強化小膠質細胞CD206 的表達；表面特異表達CD206 分子可吞噬損傷的神經細胞碎片、促進組織修復和神經元再生，起抗炎和神經修復作用。同時隨著小膠質細胞向CD206 表型轉化，促炎因子TNF-α 降低，而神經修復因子BDNF 增高。在腦出血+Nrf2-/-組中，小膠質細胞CD206 表達下調，CD80 表達上調，提示Nrf2 可調控小膠質細胞的功能轉化。

綜上所述，Nrf2 可調控小膠質細胞的功能轉化，影響腦出血后血腫清除、水腫形成及神經功能缺損；紅曲素、血脂康作為Nrf2 的激動劑，通過上調Trem2、CD206、BDNF 的表達強化小膠質細胞的吞噬功能，促進血腫產物的清除并促進神經修復；同時下調Trem1 及CD80、TNF-α 的表達，抑制小膠質細胞的炎癥反應，減輕出血后血紅蛋白含量及神經毒性而發揮神經保護作用。該研究從機制水平探索Nrf2 在腦出血后血腫清除中的作用，為未來腦出血后血腫清除的臨床干預提供了全新的研究方向及思路。