MicroRNA-27b在高血壓腦出血大鼠腦組織中的表達及對星形膠質細胞生物學功能的影響*

肖仕和，李鋼，周奮，劉珍，劉仲海

（海南省第三人民醫院神經外科，海南三亞 572022）

高血壓腦出血（hypertensive intracerebral hemorrhage, HICH）是高血壓最嚴重的并發癥之一，也是主要的致殘性疾病之一[1]。流行病學資料顯示，HICH 主要影響50～70 歲人群，30 d 病死率可達32%～50%，即使存活，約70%的患者仍會出現神經功能障礙，僅28%～35%的患者具有獨立的生活技能[2-3]。HICH 發病后神經元的損傷是導致神經功能障礙及其他并發癥的病理基礎，而星形膠質細胞參與了HICH 發病后對神經元的保護和重建[4-5]。星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的細胞類型，參與神經元的營養、保護，維持血腦屏障，并協助跨突觸的信號傳遞過程[6]。在出現腦組織損傷后，星形膠質細胞被激活，并可通過分泌各種細胞因子參與損傷后的修復，星形膠質細胞大量的凋亡影響HICH 的恢復[7-8]。 微RNA（microRNA,miRNA）是一種內源性的、約為22～25 個核苷酸長度的RNA，參與細胞增殖、凋亡、分泌等過程及細胞功能的調控[9]。microRNA-27b（miR-27b）是近年來發現的與HICH 有關的miRNA，有研究發現降低miR-27b 的表達會緩解HICH 大鼠的腦損傷[10-11]，但是其對星形膠質細胞的影響仍不清楚。本文主要分析miR-27b 在HICH 大鼠腦組織中的表達及對星形膠質細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

自發性高血壓（spontaneous hypertension，SHR）大鼠（血壓：160～180 mmHg）、健康的同源性WKY大鼠，12月齡，SPF 級，雄性，體重190～210 g（上海斯萊克實驗動物中心），實驗動物使用許可證號:SYXK（ 瓊）2022-0013；大鼠星形膠質細胞（BNCC338613，北京北納科技有限公司）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

蘇木精-伊紅和TUNEL 染料（C1091，上海碧云天生物技術有限公司）；RPMI 1640 培養基和抗體（美國Gibco 公司）；miR-27b 的類似物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及陰性對照（negative control, NC）（中國吉瑪公司）；TRIzol 試劑（北京艾德萊生物科技有限公司）；TRIzol 和miRNeasy Mini 試劑盒（德國QIAGEN有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（中國TaKaRa 公司）；CCK-8 試劑盒（C0037，上海碧云天生物技術有限公司）；凋亡試劑盒（Annexin V-FITC 和PI）（中國耶森實業有限公司）；酶標儀（日本Bio-Rad公司）；流式細胞儀（美國Becton 公司）；數碼相機（IXUS，日本佳能公司）和光學顯微鏡（ECLIPSE Ni，美國Nikon 公司）。

1.2 HICH大鼠模型復制

選取15 只健康WKY 大鼠作為對照組，15 只SHR 大鼠作為HICH 組。通過自體血腦內注射法復制HICH 模型[8]：大鼠腹腔注射10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后固定在立體定向儀中，調整儀器，使大鼠前囟和后囟處于同一平面，在前囟后側0.2 mm 處鉆孔，然后斷尾取自體血50 μL，進針6.0 mm（尾殼核處）注入50 μL 自體血，緩慢注射持續3 min，留針7 min。對照組進行相同的操作但不注射自體血。通過改良大鼠神經功能缺損評分（mNSS）評估模型復制結果。24 h 后將大鼠安樂死，取腦組織用于后續實驗檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 HE染色大鼠安樂死后取腦組織，室溫下用4%多聚甲醛固定6 h，乙醇脫水后用石蠟包埋，然后切成5 μm 厚的切片，并將這些切片貼到載玻片上，室溫下使用蘇木精染色10 min，自來水沖洗1～2 min 后，將其置于10%冰醋酸中10 s，然后再置于1%氨水中，直到切片變藍，再用自來水清洗1～2 min 后，放入伊紅液染色10 s，脫水后置于二甲苯中2 min，最后用中性膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3.2 TUNEL染色1.3.1 中的切片用二甲苯脫石蠟2 次，每次10 min，經過梯度乙醇脫水（乙醇濃度：100%、95%、90%、80%、70%），在37°C 的潮濕暗箱中用50 μL 的TUNEL 反應溶液處理切片60 min，隨后將50 μL 辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素加入其中孵育30 min，用DAPI 對細胞核進行熒光染色，常規脫水、脫色、固定。檢測細胞凋亡率并用光學顯微鏡放大400 倍捕獲圖像，計算TUNEL 陽性細胞數。細胞凋亡指數=（TUNEL 陽性細胞數/總細胞數）×100%。

1.3.3 qRT-PCR 檢測大鼠腦組織及各組細胞miR-27b mRNA 相對表達量收集大鼠腦組織及各組細胞，采用TRIzol 法從大鼠腦組織及各組細胞中提取總RNA，并使用Nanodrop 2000 進行定量。用miRNeasy Mini 試劑盒分離miRNA 并進行逆轉錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM進行qRTPCR：95°C 預變性2 min，95°C 變性30 s 退火20 s，72°C 延伸20 s，共40 個循環。miR-27b mRNA 正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAGAGCTTAGCTGATT G-3′，引物長度為 30 nt；反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCYAGTTGA GGTTCAC-3′，引物長度為43 nt；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，引物長度為17 nt；反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，引物長度為20 nt。以U6 為內參對照，使用2-ΔΔCt法計算目的基因miR-27b mRNA 相對表達量。

1.4 星形膠質細胞分組和轉染

星形膠質細胞培養于RPMI 1640 完全基中，培養基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL 的鏈霉素及100 u/mL 的青霉素。將細胞在37°C，95%濕度條件下培養于5%二氧化碳培養箱中。細胞分為3 組，NC 組、miR-27b mimic 組及miR-27b inhibitor 組，根據組別分別轉染miR-27b mimic、miR-27b inhibitor質粒來過表達和抑制miR-27b 水平。將細胞在6 孔板中培養，當細胞達到60% 匯合后，添加Opti（100 μL）和LipofectamineTM2000（5 μL）并孵育5 min作為試劑A。加入Opti（100 μL）和miR-27b mimic/inhibitor 質粒（20 ng/μL）并孵育5 min 作為試劑B。將A、B 試劑混合在一起并孵育20 min。16 h 后，更換培養基并收獲細胞。NC 組細胞轉染等量的NC 質粒作為對照。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖活力

將100 μL 的細胞懸浮液添加到96 孔板，分別孵育24 h、48 h 后，將體積為10 μL 的CCK-8 溶液添加到每個孔中并孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將細胞用1×PBS 洗滌并懸浮在100 μL 結合緩沖液中，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL的PI，并在室溫下黑暗中孵育10～15 min，最后將400 μL 的結合緩沖液添加到樣品中，并在1 h 內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩間的比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腦組織病理學檢查結果

光學顯微鏡下觀察到，對照組神經元分布均勻，細胞核結構清晰；HICH 組的細胞核染色變深，并且出現間質性水腫。見圖1。

圖1 大鼠腦組織病理學改變 （HE染色×200）

2.2 大鼠神經元凋亡情況

光學顯微鏡下觀察到，細胞核為藍色，棕褐色為TUNEL 染色陽性表達細胞，即凋亡（見圖2）。HICH 組與對照組細胞凋亡指數分別為（35.91±3.24）和（2.75±0.36），兩組比較，差異有統計學意義（t=39.400，P=0.000）， HICH 組高于對照組。

圖2 大鼠神經元凋亡情況 （TUNEL染色×400）

2.3 兩組大鼠腦組織中miR-27b mRNA相對表達量的比較

HICH 組大鼠腦組織中miR-27b mRNA 相對表達量為（3.45±0.48），對照組為（1.00±0.12），兩組比較，差異有統計學意義（t=19.180，P=0.000），HICH 組高于對照組。

2.4 3 組星形膠質細胞miR-27b mRNA 相對表達量的比較

轉染后，3 組細胞miR-27b mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-27b mimic 組高于NC 組（P＜0.05），miR-27b inhibitor 組低于NC 組（P＜0.05）。見表1。

表1 3組星形膠質細胞miR-27b mRNA相對表達量的比較 （±s）

表1 3組星形膠質細胞miR-27b mRNA相對表達量的比較 （±s）

注：?與NC組比較，P ＜0.05。

組別NC組miR-27b mimic組miR-27b inhibitor組F 值P 值miR-27b mRNA 1.00±0.09 3.86±0.35?0.62±0.05?424.448 0.000

2.5 3組星形膠質細胞增殖活力的比較

3 組星形膠質細胞增殖活力比較，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-27b mimic 組低于NC 組（P＜0.05），miR-27b inhibitor 組高于NC 組（P＜0.05）。見表2。

表2 3組星形膠質細胞增殖活力的比較 （±s）

表2 3組星形膠質細胞增殖活力的比較 （±s）

注：?與NC組比較，P ＜0.05。

組別NC組miR-27b mimic組miR-27b inhibitor組F 值P 值48 h 0.81±0.08 0.65±0.07?0.97±0.09?23.753 0.000 24 h 0.46±0.04 0.40±0.05?0.53±0.06?9.896 0.000

2.6 3組星形膠質細胞凋亡率比較

流式細胞術檢測結果顯示，3 組星形膠質細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-27b mimic 組高于NC 組（P＜0.05），miR-27b inhibitor 組低于NC 組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 3組星形膠質細胞凋亡率的比較 （%，±s）

表3 3組星形膠質細胞凋亡率的比較 （%，±s）

注：?與NC組比較，P ＜0.05。

組別NC組miR-27b mimic組miR-27b inhibitor組F 值P 值凋亡率5.73±0.56 17.89±1.40?3.12±0.35?466.797 0.000

圖3 miR-27b對星形膠質細胞凋亡的影響

3 討論

HICH 多由長期的高血壓和顱內動脈粥樣硬化引起，導致患者顱內小動脈破裂引起實質內出血[12]。HICH 早期無癥狀，多在劇烈運動或情緒起伏狀態下突然出現劇烈頭痛、煩躁或嘔吐，在數分鐘或數小時內進展為嗜睡、昏迷甚至死亡[13-14]。但是目前尚無有效治療HICH 和改善患者神經功能的方法。

miRNA 是近年來的研究熱點，其可通過堿基配對識別并結合mRNA 的3'-端的非翻譯區域，進而誘導mRNA 的降解或者抑制翻譯[15-16]。動物實驗表明腦卒中大鼠血漿中miR-27b 的水平顯著上調，并與病情嚴重程度有關[17-19]。本研究通過對SHR 大鼠進行自體血腦內注射復制HICH 大鼠模型，結果顯示復制后模型有明顯的腦組織損傷，發現大量細胞凋亡，并且出血腦組織中miR-27b mRNA 相對表達量顯著升高，這初步提示miR-27b 參與HICH后的組織損傷和神經元凋亡，但是miR-27b 對何種細胞產生影響仍不清楚。

星形膠質細胞是哺乳動物腦內分布最廣泛的一類細胞，在維持微環境穩定性和神經回路功能方面起著至關重要的作用，在正常條件下，星形膠質細胞負責調控鉀離子緩沖和神經元代謝，并通過分泌細胞因子營養神經元[20-21]。而在HICH 等病理狀態下，星形膠質細胞會被激活，不僅通過分泌炎癥細胞因子幫助清除受損組織，并且還參與神經元的重建[22]。近年來研究[23]表明星形膠質細胞受到miRNA 的調節，如miR-194-5p 通過直接靶向神經外營養蛋白抑制脂多糖誘導的星形膠質細胞活化。miR-27b 在調節細胞存活、增殖及凋亡中起到關鍵作用，如下調miR-27b 的表達會通過靶向口腔扁平苔蘚中的PLK2 的表達促進角質形成細胞增殖[24]。也有研究[25-26]顯示，提高miR-27b 水平會促進彌漫性大B 細胞淋巴瘤細胞的凋亡。為分析miR-27b 對星形膠質細胞的影響，本研究通過轉染分別復制了miR-27b 過表達和沉默的星形膠質細胞模型，并通過檢測轉染后miR-27b 的水平驗證了轉染結果。CCK-8 實驗發現過表達miR-27b 顯著抑制了星形膠質細胞的增殖能力，并促進星形膠質細胞凋亡；而miR-27b 水平的降低則促進了星形膠質細胞的增殖活力，并抑制了凋亡。結合本次的細胞實驗和動物實驗，提示HICH 發生后miR-27b水平的升高誘導星形膠質細胞的凋亡，參與HICH的損傷。然而，本次研究也有許多不足之處，首先，miR-27b 調控星形膠質細胞增殖和凋亡的機制仍需要進一步分析；其在HICH 中的作用仍需要進一步的動物實驗驗證；并且miR-27b 在HICH 中的意義也需要臨床研究證實。

綜上所述，miRNA-27b 在HICH 大鼠腦組織中顯著升高，抑制星形膠質細胞的增殖并促進其凋亡。這提示miRNA-27b 可能是診斷和治療HICH 的新靶點。