γ-聚谷氨酸高產菌株的篩選及改良酸化植煙土壤效果研究

施河麗，彭五星，向修志，舒照鶴，向必坤，王雪松，上官力，尹忠春，祁高富，譚 軍*

γ-聚谷氨酸高產菌株的篩選及改良酸化植煙土壤效果研究

施河麗1，彭五星1，向修志1，舒照鶴1，向必坤1，王雪松1，上官力1，尹忠春1，祁高富2*，譚 軍1*

（1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.華中農業大學生命科學技術學院，武漢 430070）

為挖掘具有緩解植煙土壤酸化能力的微生物菌株，采用盆栽試驗和大田試驗相結合的方法，應用生物形態學和分子生物學篩選鑒定了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）高產菌株并研究其對酸化植煙土壤的改良效果。結果表明：（1）從黃土高原干旱土壤中篩選得到一株谷氨酸非依賴型γ-PGA高產菌株副地衣芽孢桿菌285-3（）；（2）菌株285-3可有效緩解根系分泌物和復合肥料導致的土壤酸化，土壤pH平均提高0.3個單位以上；（3）菌株285-3配施有機肥，可顯著降低酸化植煙土壤可交換酸度，對煙草青枯病的防效達到47.05%，同時提高煙葉產質量。綜上所述，副地衣芽孢桿菌285-3對酸化植煙土壤有較好的改良效果，與有機肥合用具有控病和提高煙葉產質量的作用。

酸化植煙土壤；副地衣芽孢桿菌；γ-聚谷氨酸；煙草青枯病；煙葉產質量

土壤酸化進程的加速，既受外源氮沉降、酸沉降的影響，又受化學肥料施用、植物選擇性吸收、根系呼吸及根系分泌物等影響[1]。近年來我國煙區土壤酸化日趨嚴重[2]，導致青枯病等土傳病害的發生及流行加重[3-4]，對煙草生長和優質煙葉生產產生嚴重影響。目前對酸化土壤的改良主要是改變施肥方式以及使用土壤改良劑，如傳統的土壤改良劑生石灰（或石灰粉）、沸石、白云石、粉煤灰等，以及新型的土壤改良劑如牡蠣殼粉、生物質炭、腐殖酸等。隨著研究的不斷深入，化學改良劑的弊端逐漸顯現，如長期施用生石灰導致土壤板結、肥力下降[5-6]，不利于煙葉生產的長遠發展。因此，有學者提出利用生物技術改良酸化土壤的方法，特別是利用微生物對酸化土壤進行修復[7-8]。芽孢桿菌具有適應性廣、成本低、貨架期長、使用方便等優點，因而受到廣泛關注。芽孢桿菌還能產生多種有益次生代謝產物，如多肽、環肽、氨基酸、蛋白酶及香豆素等，其中γ-聚谷氨酸（γ-PGA）就是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等產生的高聚物[9]。γ-PGA主鏈上具有大量游離羧基，有很強的吸水保濕功能，可以改善土壤團粒結構，起到保水保肥作用[10-12]；還可以直接中和土壤中的氫離子以及為金屬陽離子的吸附提供位點，減少堿性陽離子的淋失，提高土壤的緩沖能力，從而維持土壤pH的穩定[13-14]。

本文從山西呂梁地區黃土高原干旱土壤中篩選獲得一株谷氨酸非依賴型γ-PGA高產菌株副地衣芽孢桿菌285-3（），并研究其對酸化植煙土壤的改良效果。首先利用盆栽試驗研究該菌株對根系分泌物和復合肥料導致的土壤酸化的影響，然后利用大田試驗研究該菌株與有機肥合用對酸化植煙土壤、煙草青枯病以及煙葉產質量的影響，為利用γ-PGA高產菌株改良酸化植煙土壤和防治煙草青枯病建立研究基礎。

1 材料與方法

1.1 γ-PGA高產菌株的篩選和鑒定

2019年1月從山西呂梁交城地區黃土高原采集土壤，稱取10 g，加入90 mL ddH2O懸浮土壤，置沸水浴5 min。冷卻后將土壤懸液進行梯度稀釋，于LB固體平板上進行涂布，37 ℃培養24 h，挑選形態大、表面光滑、濕潤、粘度高的單菌落。

將挑選的單菌落接入到發酵培養基（葡萄糖30.0 g/L，檸檬酸鈉10.0 g/L，氯化銨8.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，六水合三氯化鐵0.04 g/L，無水氯化鈣0.15 g/L，一水合硫酸錳0.1 g/L，pH 7.4）中，37 ℃、180 r/min培養36 h，所得發酵液經12000 r/min離心10 min后收集上清液，然后采用CTAB比濁法定量測定各菌株發酵上清液中γ-PGA產量[15]。

選取γ-PGA產量最高的菌株，將其在LB固體平板上劃線分離單菌落，37 ℃培養24 h后觀察菌落形態，并利用結晶紫染色后觀察細胞形狀和芽孢。采用細菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）并參照說明書方法提取菌株DNA，以16S通用引物（16SF：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；16SR：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）進行PCR擴增。PCR反應體系為：正反向引物各1 μL，模板2 μL，2×Taq Master super Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在NCBI上進行Blast比對，然后利用MEGA 5.2軟件的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹。

1.2 菌株緩解土壤酸化盆栽試驗

盆栽試驗于2021年5—7月在湖北省武漢市華中農業大學微生物農藥國家工程研究中心進行。供試烤煙品種為云煙87。盆栽試驗土壤采集于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮鑼圈巖村，土壤類型為山地黃棕壤，土壤質地為壤土，土壤pH為5.50～5.90。將試驗土壤裝于高10 cm、直徑12 cm的圓形塑料花盆，移栽6片真葉煙苗，每盆1株，移栽成活后備用。有機酸溶液為苯甲酸180 mg/L，3-苯丙酸180 mg/L，延胡索酸180 mg/L，琥珀酸84 mg/L。

1.2.1有機酸溶液模擬根系分泌物導致的土壤酸化對照組（CK）和處理組（285-3）煙苗分別于第0天、第14天和第28天灌施有機酸溶液20 mL/株，模擬煙株根系分泌物導致的土壤酸化。第1次有機酸處理后，處理組煙苗灌施菌株285-3發酵液（稀釋5倍）20 mL/株，對照組煙苗灌施空白發酵培養基（稀釋5倍）20 mL/株。

1.2.2 復合肥料導致的土壤酸化 對照組（CK）和處理組（285-3）煙苗分別于第0天、第14天和第28天施用煙草專用復合肥9.75 g/株，模擬復合肥料導致的土壤酸化。第1次復合肥處理后，處理組煙苗灌施菌株285-3發酵液（稀釋5倍）20 mL/株，對照組煙苗灌施空白發酵培養基（稀釋5倍）20 mL/株。

1.3 菌株改良酸化植煙土壤大田試驗

田間試驗于2021年4—9月在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮鑼圈巖村四組進行。供試烤煙品種和土壤類型同上述盆栽試驗。試驗開始前耕層（0～20 cm）土壤的基本理化性質為：土壤pH 4.47，有機質21.90 g/kg，堿解氮136.00 mg/kg，有效磷243.10 mg/kg，速效鉀302.00 mg/kg。

試驗設置4個處理，分別為：T1（CK），不施菌株285-3發酵液和菜籽餅肥；T2，單施菌株285-3發酵液2250 L/hm2；T3，單施菜籽餅肥1500 kg/hm2；T4，菌株285-3發酵液2250 L/hm2+菜籽餅肥1500 kg/hm2。每個處理3次重復，隨機區組設計。2021年5月1日移栽，每小區3行，每行20株，行距1.20 m，株距0.55 m。施肥配比為(N)∶(P2O5)∶(K2O)=1∶1.5∶3，各處理具體施肥量見表1。煙草專用復合肥、磷肥和菜籽餅肥作為底肥，硝銨磷肥作為提苗肥，硫酸鉀作為追肥。菌株285-3發酵液（稀釋5倍）在煙苗移栽15 d后灌施。

表1 各處理基本情況

1.4 樣品采集與分析方法

盆栽試驗第1次處理后，每隔7 d用五點法從花盆10～20 cm土層中采集土樣；大田試驗在煙葉成熟采收結束后，用五點法采集每個小區0～20 cm耕層土壤。將采集的土壤樣品混勻后自然風干、去雜、研磨和過篩，然后用于測定土壤基本化學性質。土壤pH采用電位法（水土比2.5∶1）[16]，陽離子交換量采用三氯化六氨合鈷浸提-分光光度法[17]，可交換酸度、可交換氫和可交換鋁采用氯化鉀提取-滴定法[18]。

依據GB/T 23222—2008調查各處理在旺長期和成熟期煙草青枯病的發生情況，計算發病率、病情指數和防治效果。依據GB 2635—1992進行煙葉分級，計算煙葉產量、產值、均價等經濟指標。

1.5 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2010軟件進行處理，DPS 15.10統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 γ-PGA高產菌株的篩選和鑒定

2.1.1 γ-PGA高產菌株的篩選 將采集的土壤經高溫煮沸后殺死不能形成芽孢的微生物，然后適當稀釋后涂布LB平板，發現稀釋度為10-5涂布后生長出來的菌落能夠較好分開，每個平板約31～56個菌落。根據文獻報道，γ-PGA生產菌株的菌落多為粘稠擴散形態，據此初篩得到11株菌落形態較為粘稠擴散的菌株。將各菌株的單菌落接種于發酵培養基中進行培養，然后采用CTAB比濁法定量測定各菌株發酵液中γ-PGA產量。由表2可知，篩選得到的11株菌均能生產γ-PGA，產量在7.18～20.70 g/L之間，其中以菌株285-3的產量最高。

表2 各菌株γ-PGA的產量

2.1.2 γ-PGA高產菌株的鑒定 首先利用解剖鏡對菌株285-3的單菌落進行形態學觀察，發現該菌株菌落光滑濕潤，邊緣規整，中部凸狀隆起不透明；菌落顏色為淡黃色、有光澤、呈球形乳液狀；粘液挑起有明顯的拔絲效果（圖1A）。表明菌株285-3的菌落表面覆蓋大量γ-PGA分子，從而導致菌落形態粘稠，符合γ-PGA生產菌株的特征。結晶紫染色后，在顯微鏡下可見菌體為短桿狀，有芽孢（圖1B），結合該菌株分離時的沸水浴處理，推測菌株285-3為芽孢桿菌。

為了進一步確定菌株285-3的分類，利用相近芽孢桿菌的16S rDNA基因序列構建系統發育樹，發現菌株285-3與Bac48的遺傳距離最近，聚于同一個分支（圖2），且同源性為100%。因此，結合上述形態特征及分子生物學鑒定結果，將菌株285-3鑒定為副地衣芽孢桿菌（）。

注：A，菌落形態；B，芽孢。Note: A, Colony; B, Spore.

圖2 基于16S rDNA序列構建的菌株285-3的系統發育樹

2.2 菌株285-3緩解土壤酸化盆栽試驗效果

通過添加有機酸模擬根系分泌物對土壤的酸化作用，發現處理組和對照組的土壤pH隨時間的變化曲線較為平緩，但處理組土壤pH在多個時間點顯著高于對照組，較對照組平均提高了0.31個單位（圖3A）。通過添加煙草專用復合肥模擬復合肥料對土壤的酸化作用，發現處理組和對照組的土壤pH隨時間的變化曲線呈持續下降趨勢，處理組土壤pH在多個時間點也顯著高于對照組，較對照組平均提高了0.36個單位（圖3B）。盆栽試驗結果表明，菌株285-3具有緩解根系分泌物和復合肥料導致的土壤酸化的能力。

注：A，根系分泌物導致的土壤酸化；B，復合肥料導致的土壤酸化；**表示在0.01概率水平上差異顯著；*表示在0.05概率水平上差異顯著。

Note: A, soil acidification caused by root exudates; B, soil acidification induced by compound fertilizer; ** is significantly at the 0.01 probability levels; * is significantly at the 0.05 probability levels.

圖3 菌株285-3發酵液對盆栽土壤pH的影響

Fig. 3 Effect of strain 285-3 fermentation broth on pH of potted soil

2.3 菌株285-3改良酸化植煙土壤的大田試驗效果

2.3.1 對酸化植煙土壤化學性質的影響 由表3可知，部分處理在土壤可交換酸度、可交換鋁和可交換氫等指標間差異達到顯著水平。T3處理和T4處理的土壤可交換酸度顯著低于T1處理（CK），T1處理（CK）、T3處理和T4處理的土壤可交換鋁顯著低于T2處理，T2處理的土壤可交換氫顯著低于T1處理（CK）。說明單施菌株285-3、單施菜籽餅肥、菌株285-3與菜籽餅肥合用都對酸化植煙土壤具有一定的改良效果。

2.3.2 對煙草青枯病發生的影響 由表4可知，旺長期各處理煙草青枯病發病率和病情指數都較低。成熟期各處理煙草青枯病發生明顯加重，但T4處理的發病率和病情指數均顯著低于T3處理。與T1處理（CK）相比，T4處理對煙草青枯病的防效為47.05%，說明菌株285-3與菜籽餅肥合用對煙草青枯病具有較好的防控效果。

2.3.3 對煙葉經濟性狀的影響 表5表明，不同處理在煙葉產量和產值間差異達到顯著水平，其中T1處理（CK）和T3處理的產量均顯著低于T4處理，T3處理的產值顯著低于T4處理。與T1處理（CK）相比，T4處理的增產率和增值率均為最高，分別為15.20%和8.57%；T2處理的增產率和增值率次之，分別為3.51%和0.85%；T3處理的產量和產值均低于T1處理（CK）。以上結果表明，菌株285-3與菜籽餅肥合用有利于增加烤后煙葉經濟性狀。

表3 不同處理的土壤化學性質

注：同一列中小寫字母不同表示處理間差異顯著（<0.05），下同。

Note: Different lowercase letters in the same columu indicate significant differences between treatments(<0.05), the same below.

表4 不同處理煙草青枯病的發生情況

Table 4 Occurrence of tobacco bacterial wilt in different treatments

表5 不同處理的經濟性狀

3 討 論

γ-PGA是一種可由多種微生物合成的，具有生物降解性的水溶性生物高分子材料，在農業上可用作土壤改良劑[19-20]。目前報道的γ-PGA生產菌株大多是芽孢桿菌屬，根據發酵過程中是否添加谷氨酸，可將γ-PGA生產菌株分為谷氨酸依賴型菌株和谷氨酸非依賴型菌株。許多微生物高產γ-PGA的時候需要外源添加谷氨酸作為底物，而土壤中往往匱乏谷氨酸，如果可以不依賴于外源添加谷氨酸就能生產較高產量的γ-PGA，能夠從葡萄糖開始經糖酵解（EMP）途徑和三羧酸（TCA）循環自己合成谷氨酸，則理論上更有利于菌株在土壤中發揮緩解酸化的作用[21]。本研究從黃土高原干旱土壤中篩選獲得一株谷氨酸非依賴型菌株，并將該菌株鑒定為副地衣芽孢桿菌，其γ-PGA產量達到20.70 g/L，而谷氨酸非依賴型菌株γ-PGA產量達到20 g/L以上的少見報道[22-23]。

通過盆栽試驗發現，菌株285-3對根系分泌物和復合肥料導致的土壤酸化都具有明顯的緩解和改善作用，處理組土壤pH較對照組平均提高0.30個單位以上，且在多個時間點顯著高于對照組。用有機酸模擬根系分泌物處理土壤后，對照組土壤pH并沒有明顯下降，可能是施加的有機酸被土壤中的細菌作為碳源所利用，實際上許多微生物都可以利用有機酸作為碳源[24]。用煙草專用復合肥處理土壤后，對照組土壤pH持續下降，而菌株285-3處理組土壤pH在多個時間點高于初始pH，一方面可能是因為施用的復合肥料被菌株285-3作為氮源所利用，另一方面菌株285-3生產的γ-PGA對酸、堿具有極佳的緩沖能力，可有效平衡土壤酸堿值，緩解因長期使用化學肥料引起的土壤酸化現象[25]。雖然γ-PGA在農業中有多種應用，如土壤保墑、重金屬治理、肥料增效等，但作為酸化土壤改良劑則報道較少。

進一步將菌株285-3用于大田酸化植煙土壤的改良發現，單施菌株285-3、單施菜籽餅肥以及菌株285-3與菜籽餅肥合用對于酸化植煙土壤改良都有一定的效果，而菌株285-3與菜籽餅肥合用對煙草青枯病防治和煙葉產質量提升的田間效果更佳。單施285-3發酵液可能因菌株不能在土壤中有效定殖而無法充分發揮其效果[26]。由于餅肥在土壤微氧的環境中發酵產生有機酸[27]，而這些酸類物質會對煙株根系的生長發育產生抑制作用，因此單施菜籽餅肥對于煙草青枯病防治和煙葉產質量提升的效果較差。菜籽餅肥與菌株285-3合用田間效果最佳。菜籽餅肥既可以起到疏松土壤、改善土壤微生物群落、增加營養元素等作用[28]，又可以為菌株285-3在土壤中的擴繁與根際定殖提供必要的營養以及為合成γ-PGA提供所需的原料[29-30]。此外，γ-PGA在改善土壤特性[31]、增強土壤持水能力、減少養分流失[32]、促進根區微生物群的生長[33]等方面都具有良好的效果，能使作物更有效的吸收土壤中的水分和養分，促進根系生長發育，提高作物對土傳病害的抵抗能力。前人已將γ-PGA作用于多種作物，并表現出明顯的促生長和增產作用[34]。

4 結 論

本研究從黃土高原干旱土壤中篩選得到一株谷氨酸非依賴型γ-PGA高產菌株，將其鑒定為副地衣芽孢桿菌285-3（）。該菌株具有緩解根系分泌物和復合肥料導致的土壤酸化的作用；在大田與有機肥合用不僅對酸化植煙土壤有較好的改良效果，而且能防控煙草青枯病和提高煙葉產質量。本研究為今后利用微生物及γ-PGA對酸化土壤進行修復提供了技術支持和借鑒指導。

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Screening of Poly-γ-glutamic Acid Producer and its Effect on Improving Acidified Tobacco Planting Soil

SHI Heli1, PENG Wuxing1, XIANG Xiuzhi1, SHU Zhaohe1, XIANG Bikun1, WANG Xuesong1, SHANG Guanli1, YIN Zhongchun1, QI Gaofu2*, TAN Jun1*

（1. Enshi Prefecture Company of Hubei Provincial Tobacco Corporation, Enshi, Hubei 445000, China; 2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China）

In order to explore the microbial strains with the ability to alleviate the acidification of tobacco planting soil, a combination of biomorphology and molecular biology, pot experiment and field experiment were used to screen and identify high-yielding γ-PGA strains and study their improvement effects on acidified tobacco planting soil. The results showed that: (1) Aglutamate-independent γ-PGA producing strain285-3 was screened from the arid soil of the Loess Plateau. (2) Strain 285-3 effectively alleviated soil acidification caused by root exudates and compound fertilizers, and increased soil pH by more than 0.3 units on average. (3) The combination of strain 285-3 and organic fertilizer significantly reduced the exchangeable acidity of acidified tobacco planting soil, and the control effect of tobacco bacterial wilt reached 47.05%, while improved the yield and quality of tobacco. In conclusion,285-3 has a good improvement effect on acidified tobacco plating soil, and can control disease and improve yield and quality of tobacco when combined with organic fertilizer.

acidified tobacco planting soil;; γ-PGA; tobacco bacterial wilt; tobacco yield and quality

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.003

S572.01

A

1007-5119（2022）04-0015-07

中國煙草總公司湖北省公司科技項目（027Y2019-011）

施河麗（1984-），女，碩士研究生，主要從事煙草栽培與微生物工程研究。E-mail：shiheli2022@163.com

，E-mail：祁高富，qigaofu@mail.hzau.edu.cn；譚軍，tanjun20713@163.com

2022-03-07

2022-08-09