福建醇化煙葉倉庫空氣中真菌多樣性研究

陳善義，李菁菁，劉景川，張瑞強，王雨晴，何 偉，簡少平，詹仁鋒，方 璟，龍 騰，姜振錕*

福建醇化煙葉倉庫空氣中真菌多樣性研究

陳善義1，李菁菁1，劉景川2，張瑞強3，王雨晴4，何 偉1，簡少平3，詹仁鋒1，方 璟1，龍 騰1，姜振錕1*

（1.福建中煙工業有限責任公司技術中心，福建 廈門 361021；2.龍巖煙草工業有限責任公司，福建 龍巖 364021；3.廈門煙草工業有限責任公司，福建 廈門 361026；4.福州大學食品科學技術研究所，福建省食品生物技術創新工程技術研究中心，福州 350108）

為研究煙葉醇化倉庫空氣中真菌的多樣性，選取龍巖東肖、龍巖紅炭山、廈門東孚3座煙葉倉庫1～5樓層的空氣為研究對象，于2019年1—12月利用空氣采樣法對倉庫各樓層空氣中真菌進行月度采集、分離、鑒定。結果表明：（1）3座倉庫各樓層空氣中真菌的含量均呈現夏季多而其他季節少的規律，東肖、紅炭山倉庫空氣中真菌的含量高于東孚倉庫，其最高值分別是東孚倉庫的10.9倍和9.4倍。（2）3座倉庫空氣中共分離獲得835株真菌，歸屬于3個門、10個綱、54個屬、158個種，且優勢菌屬為、和，菌株數量占倉庫空氣中分離所得總菌株數比例大于10%的菌種為、、、和。韋恩圖分析結果表明，東肖、紅炭山、東孚倉庫空氣中分離獲得的真菌種類數分別為68、92、68。其中，3座倉庫共有的真菌為20種，東肖、紅炭山、東孚倉庫特有的真菌種類數分別為26、45、37。（3）一年中，倉庫空氣中真菌種類在冬季相對較多，而在春末夏初相對較少。、和是倉庫空氣中較為穩定存在的真菌菌種。

倉儲養護；空氣微生物采樣；真菌

片煙醇化是提高卷煙原料品質的重要手段。片煙在倉儲養護過程中若保管不當（如倉庫衛生條件較差、庫內環境溫濕度過大等）則容易發生霉變。煙葉的霉變是煙葉中真菌在適宜環境條件下大量生長和繁殖的結果[1-2]。煙葉中含有真菌生長所需的蛋白質和還原糖等多種營養物質，再加上煙葉本身吸濕性強的特性[3]，這些因素給倉儲養護的片煙帶來了霉變的風險。空氣中存在著多種真菌[4]，片煙在倉儲養護過程易沾染真菌孢子。目前，有關煙葉倉庫空氣中真菌多樣性研究較少。姜振錕等[5]分析了倉庫空氣中真菌組成，而對于真菌的含量變化規律及多個地區倉庫真菌區系的差異并未進行系統地研究。為此，本研究選取龍巖、廈門兩地共3座煙葉倉庫為研究對象，利用空氣采樣法對倉庫空氣中真菌進行采集、分離及ITS鑒定，系統研究倉庫空氣中真菌含量的月度變化規律及不同倉庫空氣中真菌的組成，旨在為片煙霉變的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

培養基：氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司。按產品說明書進行配置，于121 ℃下滅菌15 min，冷卻至50 ℃左右后，加入硫酸鏈霉素[購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]，使其終濃度為50 μg/mL，以抑制細菌的生長。

其他試劑：Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Plus DNA聚合酶、dNTP Mixture（10 mmol/L），購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器：空氣微生物采樣器，型號MAS-100NT，購自德國Merck公司；滅菌鍋，型號VX-95，購自德國Systec公司；超凈工作臺，型號SW-CJ-1FD，購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；生化培養箱，型號BPC-500F，購自上海一恒科技有限公司。

1.2 倉庫空氣中真菌的采集、培養和計數

試驗于2019年1—12月進行，每個月進行1次倉庫空氣中真菌的采集。試驗地點為龍巖煙草工業有限責任公司的東肖煙葉倉庫（2012年建成并投入使用，庫內環境年平均溫度24.7 ℃、年平均相對濕度64.2%）、紅炭山煙葉倉庫（1995年建成并投入使用，庫內環境年平均溫度19.6 ℃、年平均相對濕度64.7%）和廈門煙草工業有限責任公司的東孚煙葉倉庫（2016年建成，庫內環境年平均溫度25.9 ℃、年平均相對濕度58.3%），每個地點各選1座，每座共5層。試驗時，每個樓層重復取樣3次。

倉庫空氣中真菌的采集方法如下：以氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養基為采集培養基，將培養皿蓋子打開后，迅速放入空氣微生物采樣器內的采樣頭上并固定好，蓋上采樣蓋，設定采樣體積為100 L，按儀器操作說明書進行采樣。采樣完成后，取下培養皿，迅速蓋上培養皿蓋，用Parafilm封口膜進行密封。

將所得培養皿帶回實驗室，置于生化培養箱中，28 ℃條件下培養3～5 d。待菌落長出后，統計各培養皿形成的菌落數，以每100 L空氣采集獲得的菌落數（CFU/100 L）（CFU，colony forming unit，即菌落形成單位）為單位表征倉庫空氣中真菌的含量，利用SPSS 18.0軟件進行數據的統計及分析。

1.3 真菌的物種鑒定

于超凈工作臺中，挑取不同形態（菌落形狀、顏色、表面狀態、隆起狀態、邊緣形狀、孢子顏色、菌絲顏色等）的單菌落，轉移至新的氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養基中，28 ℃下培養3～5 d。從菌落的邊緣處挑取少量菌絲，轉移至新培養基中，重復3次上述操作進行純化。

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品基因組DNA。PCR所用引物為ITS1-F（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[6]。反應體系：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L)、0.5 μLPlus DNA Polymerase（5 U/μL），10 μmol/L正、反向引物各1 μL，1 μL模板DNA，補足ddH2O至25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠對所得擴增產物進行電泳檢測。PCR產物的測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，參照張真娜等[7]的方法進行真菌物種的鑒定。

2 結 果

2.1 倉庫空氣中真菌含量變化

由圖1可知，龍巖東肖、龍巖紅炭山及廈門東孚倉庫各樓層空氣中真菌的含量均呈現夏季多而其他季節少的規律。龍巖東肖、龍巖紅炭山倉庫中真菌的含量總體上高于廈門東孚倉庫，最高值分別為1176.7和1018.7 CFU/100 L，是廈門東孚倉庫最高值（108.3 CFU/100 L）的10.9倍和9.4倍。

注：a，龍巖東肖倉庫；b，龍巖紅炭山倉庫；c，廈門東孚倉庫。

2.2 倉庫空氣中真菌的分離和鑒定

利用氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養基，從3座倉庫各樓層空氣中共分離獲得835株真菌。根據ITS鑒定結果進行歸類，發現這835株真菌歸屬于3個門、10個綱、54個屬、158個種（表1）。屬于Ascomycota門的真菌有782株，所占比例為93.65%；屬于Basidiomycota門的真菌有50株，所占比例為5.99%；屬于Mucoromycota門的真菌有3株，所占比例為0.36%。Ascomycota門包含5個綱：Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes、Saccharomycetes和Sordariomycetes，共43個屬。Basidiomycota門包含4個綱：Agaricomycetes、Exobasidiomycetes、Microbotryomycetes、Tremellomycetes，共9個屬。Mucoromycota門僅有1個綱：Mucoromycetes，共2個屬。

2.3 不同倉庫空氣中真菌的多樣性比較

在屬分類水平上進行不同倉庫空氣中真菌的多樣性比較（圖2），發現東肖倉庫屬包含的菌株數目最多，占該倉庫分離獲得的總菌株數的47.35%（116/245）；其次為屬、屬，分別占31.43%（77/245）、8.57%（21/245）。紅炭山倉庫屬包含的菌株數目最多，占該倉庫分離獲得的總菌株數的34.87%（106/304）；其次為屬、屬，分別占30.59%（93/304）、15.46%（47/304）。東孚倉庫屬包含的菌株數目最多，占該倉庫分離獲得的總菌株數的43.36%（124/286）；其次為屬、屬，分別占27.27%（78/286）、9.44%（27/286）。由此可見，、、這3個屬為東肖、紅炭山、東孚倉庫的優勢菌屬。

表1 倉庫空氣中分離獲得的真菌種類數目

表1（續）

Table 1 continued

進一步在種分類水平上進行不同倉庫空氣中真菌的多樣性比較。由圖3可知，東肖倉庫中，菌株數量占該倉庫分離所得總菌株數量比例大于10% 的菌種為、和，所占比例分別為11.84%（29/245）、10.61%（26/245）和10.20%（25/245）；紅炭山倉庫中，菌株數量占該倉庫分離所得總菌株數量比例大于10%的菌種為，所占比例為11.18%（34/304）；東孚倉庫中，菌株數量占該倉庫分離所得總菌株數量比例大于10%的菌種為、和，所占比例分別為13.29%（38/286）、12.24%（35/286）和10.14%（29/286）。

注：DX，龍巖東肖倉庫；HTS，龍巖紅炭山倉庫；DF，廈門東孚倉庫。下同。

圖3 三座倉庫主要真菌各種菌株數目所占比例

韋恩圖可以分析不同倉庫共有和特有的真菌種類。由圖4可知，東肖、紅炭山、東孚倉庫分離獲得的真菌種類數分別為68、92、68。其中，3座倉庫共有的真菌有20種，東肖、紅炭山、東孚倉庫特有的真菌種類數分別為26、45、37。由此可見，紅炭山倉庫含有的真菌種類數最為豐富，且特有的真菌種類數最多。

圖4 不同倉庫空氣真菌種類韋恩圖分析

2.4 不同倉庫空氣中真菌的種類變化分析

由圖5可知，三座倉庫空氣中每月分離所得真菌的種類數為7～26，其中1、2月份獲得的種類數最多，而4、5、6月份獲得的種類數較少。由此可見，一年中，倉庫空氣中真菌種類在冬季相對豐富，而在春末夏初相對單一。

圖5 不同倉庫空氣真菌種類數月度變化

在12次的月度采樣中，對3個倉庫空氣中出現6次及以上的真菌進行統計（表2）。結果發現，有8種真菌出現至少6次，為、、、、、、、。其中在東肖、紅炭山、東孚倉庫的12次月度采樣中分別出現了10、11、11次。此外，和在東孚倉庫的12次月度采樣中分別出現了11次和10次。這說明，、和是倉庫空氣中較為穩定存在的真菌菌種。

表2 不同倉庫空氣中出現6個月及以上的真菌種類統計

3 討 論

利用空氣采樣法對龍巖東肖、龍巖紅炭山、廈門東孚3座倉庫各樓層空氣中真菌進行了采集、分離、培養及ITS鑒定，發現倉庫各樓層空氣中真菌的含量均呈現夏季多而其他季節少的規律，說明倉庫空氣中真菌在夏季繁殖迅速。這種規律在向東紅[8]對川渝地區不同季節倉儲片煙的真菌污染情況調查中也有發現。福建地處中國東南部，夏季高溫高濕，利于真菌的生長和繁殖。因此，在片煙的倉儲養護過程中，要重點做好夏季的防霉措施。比較3座倉庫空氣中真菌的數量發現，東孚倉庫的真菌數量少于東肖和紅炭山倉庫，可能原因是東孚倉庫年平均環境相對濕度（58.3%）低于東肖倉庫（64.2%）和紅炭山倉庫（64.7%）。同處于龍巖市的紅炭山和東肖倉庫年平均環境相對濕度相差不大，盡管紅炭山倉庫年平均環境溫度（19.6 ℃）低于東肖倉庫（24.7 ℃），但韋恩圖分析表明紅炭山倉庫空氣中真菌的種類數（92種）依然大于東肖倉庫（68種）。可能的原因有2個：一是使用年限較長的倉庫，空氣中的真菌得以更長時間的富集；二是不同來源的片煙本身含有的真菌種類不一樣[9]。

本研究分離獲得的54個屬中，有5個屬可致煙草制品發生霉變。其中、、、4個屬可致醇化片煙發生霉變[8, 10-12]，屬對煙葉的致霉性尚未見報道，但可致成品卷煙煙支發生霉變[13]。本研究發現，、、是醇化煙葉倉庫空氣中的優勢菌屬。可見，福建地區醇化煙葉倉庫空氣中的優勢菌屬均為致霉菌，下一步應對這些優勢霉菌系統開展生物學特性及致霉條件研究，以便為片煙的防霉養護提供理論支持。

在種分類水平上，姜振錕等[5]的研究中發現菌株數量占煙葉倉庫空氣中分離所得總菌株數量比例大于10%的菌種為、和，是煙葉醇化倉庫空氣中的優勢菌種。本研究發現除上述3種真菌以外，菌株數量占煙葉倉庫空氣中分離所得總菌株數量比例大于10%的菌種還有和，可能是本研究采集的樓層更多，時間跨度更大，因而可發現更多的優勢真菌種類。

對不同月份采集獲得的真菌種類數進行統計分析發現，冬季真菌種類數相對較多，而春末夏初相對較少。這可能是冬季環境溫濕度相對較低，各類真菌生長和繁殖較慢，而春末夏初時，氣溫回升，相對濕度較大，一些種類的真菌得以快速生長和繁殖，并形成優勢菌群，造成采集獲得的真菌種類數相對較少。

4 結 論

結果表明，福建地區煙葉醇化倉庫庫內環境空氣中真菌的含量夏季多，其他季節少，東肖、紅炭山倉庫空氣中真菌的含量高于東孚倉庫。煙葉醇化倉庫庫內環境中真菌種類豐富，3座倉庫共獲得835株真菌，歸屬于3個門、10個綱、54個屬、158個種，菌株數量占倉庫分離所得總菌株數量比例大于10%菌種為、、、和。一年中，倉庫空氣中真菌種類在冬季相對較多，而在春末夏初相對較少。、和是倉庫空氣中較為穩定存在的真菌種類。

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Diversity of Aerial Fungi in Tobacco Warehouse in Fujian Province

CHEN Shanyi1, LI Jingjing1, LIU Jingchuan2, ZHANG Ruiqiang3, WANG Yuqing4, HE Wei1, JIAN Shaoping3, ZHAN Renfeng1, FANG Jing1, LONG Teng1, JIANG Zhenkun1*

(1. Technology Center, China Tobacco Fujian Industrial Co., Ltd., Xiamen, Fujian 361021, China; 2. Longyan Tobacco Industrial Co., Ltd., Longyan, Fujian 364021, China; 3. Xiamen Tobacco Industrial Co., Ltd., Xiamen, Fujian 361026, China; 4. Institute of Food Science and Technology, Fuzhou University, Fujian Center of Excellence for Food Biotechnology, Fuzhou 350108, China)

To study the diversity of fungi in the air of tobacco warehouses, monthly collection, isolation and identification of fungi in the air of floors 1-5 of 3 warehouses (Dongxiao in Longyan, Hongtanshan in Longyan and Dongfu in Xiamen) were carried out with the air sampling method from January to December in 2019. The results showed that: (1) The fungal quantity in the air of each floor of the three warehouses was high in summer but low in other seasons, and the content of fungi in the air of Dongxiao and Hongtanshan warehouses were higher than that of Dongfu, with the highest value being 10.9 and 9.4 times of Dongfu, respectively. (2) A total of 835 fungal strains, belonging to 3 phyla, 10 classes, 54 genera and 158 species, were obtained from the 3 warehouses. The dominant genera were,and.,,,andwere the species that accounted for more than 10% of the total isolates number in the air of the tobacco warehouses. The results of Venn diagram analysis showed that 68, 92 and 68 species of fungi existed in the warehouses of Dongxiao, Hongtanshan and Dongfu, respectively. 20 species were common to the 3 warehouses, and the numbers of specific species for the warehouses in Dongxiao, Hongtanshan and Dongfu were 26, 45 and 37, respectively. (3) The numbers of fungal species in the air of tobacco warehouses were relatively high in winter, but relatively low in late spring and early summer over a period of one year.,andwere relatively steady fungal species in the air of tobacco warehouses.

storage and maintenance; airborne microbes sampling; fungi

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.007

S435.72

A

1007-5119（2022）04-0048-07

福建中煙工業有限責任公司科技項目（FJZYKJJH2018011）

陳善義（1988-），男，農藝師，碩士，研究方向：煙草原料研究。E-mail：chensy188@126.com。*通信作者，E-mail：jzk23326@fjtic.cn

2022-02-11

2022-08-01