基于TCGA 數據庫分析SLC5A1 在胰腺癌中的表達及潛在促癌作用

陳譜，袁黎玥，雷雨陽，張曈欣，袁佳，郭輝，施秉銀，強薇

胰腺癌以胰腺導管癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）最為常見，是惡性程度最高的消化系統實體腫瘤，近年來其發病率在全球范圍內持續上升。胰腺癌預后極差，5 年生存率僅約6%［1-2］。分析主要原因是：疾病早期缺乏典型癥狀，確診時往往已喪失根治性手術的機會；同時，其具有高侵襲轉移特性，易于復發和轉移；對現有化療藥物產生耐藥，缺乏有效的化療及靶向藥物。因此，尋找胰腺癌轉移之前的診斷方法以及胰腺癌治療的有效靶點尤為重要。

葡萄糖是哺乳動物細胞的基本能量來源。截至目前，哺乳動物中葡萄糖轉運體（glucose transporter，GLUT）和鈉-葡萄糖轉運體（sodium-glucose cotransporter，SGLT）2 個家族的葡萄糖轉運體已被鑒定［3-4］。人類GLUT 家族在所有的組織中均有表達，以順濃度梯度（易化擴散）的形式轉運葡萄糖。而SGLTs 表達于人體代謝活躍的細胞，借助細胞膜兩側的鈉離子濃度梯度實現葡萄糖的逆濃度梯度轉運。SGLT 家族成員研究最多的是溶質載體家族5-成員1（solute carrier family 5-member 1，SLC5A1）和鈉-葡萄糖協同轉運蛋 白2（sodium - dependent glucose transporters 2，SGLT2）。SGLT2 由溶質載體家族5-成員2（solute carrier family 5-member 2，SLC5A2）基因編碼，主要分布于腎皮質，是腎臟葡萄糖重吸收的關鍵分子［5］。SGLT1 由SLC5A1 基因編碼，在小腸和腎近端小管細胞負責葡萄糖攝取。腫瘤細胞需要大量的葡萄糖來維持其增殖，代謝重編程已被認為是腫瘤的特征之一［6］。而SLC5A1 和SLC5A2 的高表達在結腸/結直腸、肺、卵巢、頭部、頸部和口腔鱗狀上皮癌中已有相關報道［4］。靶向代謝治療癌癥被認為極具前景。葡萄糖攝取增高也是胰腺癌代謝重編程的重要環節。新近研究發現，SLC5A2 在胰腺癌中表達亦增高，而其抑制劑可抑制小鼠胰腺癌移植瘤生長［7］。本課題組的另一篇文章已對SLC5A2 進行了分析研究。本研究通過對癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫中胰腺癌患者的數據與臨床病理資料進行分析，明確SLC5A1 在胰腺癌中的表達情況，探討其異常表達與臨床病理及腫瘤發生、發展的相關性。

1 資料與方法

1.1 數據來源 胰腺癌的RNA 測序數據是從TCGA 數據庫（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）中獲取，正常胰腺組織的RNA 測序數據是從TCGA 數據庫及基因組織表達（genotype-tissue expression，GTEx）數據庫中共同獲取的。

1.2 基因共表達、信號通路富集及數據分析cBioPortal（http：//www.cbioportal.org/）是一個開放獲取資源，可進行多維癌癥基因組學交互分析，LinkedOmics（http：//www.linkedomics.orglogin.php）是一個包含32 種TCGA 癌癥多組學數據的開放資源網站。利用cBioPortal 和LinkedOmics 數據庫進行胰腺癌中SLC5A1 共表達基因的分析。利用可視化注釋和集成探索在線數據庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）及KEGG（https：//www.kegg.jp/）進行功能注釋和通路富集分析。通過基因表達譜交互分析在線數據庫GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）獲取TCGA 及GTEx 數據庫中的RNA 測序數據，并比較SLC5A1 在胰腺癌（179 例）與正常胰腺組織（171 例）中mRNA 的表達，并分析SLC5A1 mRNA 表達水平與不同臨床特征的相關性，如患者的種族、腫瘤的病理分期、淋巴結轉移、組織學分型等。胰腺癌根據基因分型可分為4 種類型：（1）鱗狀型；（2）胰腺祖細胞型；（3）免疫原性型；（4）異常分化的內分泌外分泌型（aberrantly differentiated endocrine exocrine，ADEX）。本研究對4 種亞型相關基因胰島素（insulin，INS）、核受體亞家族5-組A-成員2（nuclear receptor subfamily 5-group A-member 2，NR5A2）、蛋白酶-絲氨酸-3（protease-serine-3，PRSS3）、叉頭框A3（forkhead box A3，FOXA3）、肝細胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor 1-alpha，HNF1A）、叉頭框A2（forkhead box A2，FOXA2）、肝細胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor1β，HNF1B）、胰十二指腸同源框因子-1（pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1）、肝細胞核因子4-γ（hepatocyte nuclear factor 4-gamma，HNF4G）、肝細胞核因子4-α（hepatocyte nuclear factor 4-alpha，HNF4A）、多毛和增強子斷裂1（hairy and enhancer of split 1，HES1）等與SLC5A1 的表達進行相關性分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0 軟件（Chicago，IL，USA）進行統計學分析。計量資料采用±s表示，2 組數據間的比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Spearman 分析。采用Log rank 檢驗進行生存分析。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLC5A1 在胰腺癌的表達及其與臨床病理特征的相關性 如圖1A 所示，對TCGA 數據庫中的數據分析發現，在胰腺癌組織中的SLC5A1 mRNA表達高于正常胰腺組織（P<0.05）。SLC5A1 的表達與患者的種族相關（P=0.002），但與年齡、臨床病理階段、病理TNM 分期、組織學分型、淋巴結轉移等無相關性。見表1。如圖1B 所示，相較于SLC5A1低表達的患者，SLC5A1 高表達的患者總生存時間雖呈現減低趨勢，但差異無統計學意義（P=0.075）。而如圖1C 所示，SLC5A1 高表達及低表達患者的無病生存時間比較差異無統計學意義（P=0.870）。

表1 SLC5A1 的表達與胰腺癌臨床病理特征的相關性

圖1 TCGA 數據庫分析在胰腺癌組織中的SLC5A1 mRNA 表達

2.2 與SLC5A1 表達相關的基因 進一步用cBioPortal 分析胰腺癌中與SLC5A1 表達呈正相關以及負相關的基因，見圖2A；GO 分析顯示大多數與SLC5A1 相關的基因位于細胞膜和細胞核，負責蛋白和離子的結合，參與細胞生物功能和代謝調節，見圖2B。KEGG 分析進一步提示，SLC5A1 的高表達與包括葡萄糖攝取、糖酵解信號通路等細胞代謝相關的通路以及細胞色素P450 介導的藥物代謝激活呈正相關。SLC5A1 的高表達還與青少年發病的成年型糖尿病的信號通路激活呈正相關，見表2。

表2 胰腺癌中與SLC5A1 表達正相關及負相關的信號通路

圖2 胰腺癌中SLC5A1 相關基因

2.3 SLC5A1 表達與胰腺癌不同亞型基因的相關性分析 本研究對胰腺癌4 種亞型相關基因與SLC5A1 的表達進行相關性分析，結果發現SLC5A1的表達與ADEX 型胰腺癌相關基因中的INS（r=0.174 8，P<0.05）、NR5A2（r=0.331 7，P<0.001）、PRSS3（r=0.207 7，P<0.05）表達呈正相關。見圖3。SLC5A1 表達與胰腺祖型胰腺癌中糖代謝關鍵基因FOXA3（r=0.294 4，P<0.001）、HNF1A（r=0.234 0，P<0.05）、FOXA2（r=0.193 5，P<0.05）、HNF1B（r=0.545 4，P<0.001）、PDX1（r=0.370 1，P<0.001）、HNF4G（r=0.628 3，P<0.001）、HNF4A（r=0.473 2，P<0.001）、HES1（r=0.300 1，P<0.001）表達呈正相關。見圖4。與鱗狀型、免疫原性型無明顯相關性。

圖3 SLC5A1 表達與ADEX 型胰腺癌相關性分析

圖4 SLC5A1 表達與胰腺祖細胞亞型胰腺癌相關性分析

3 討論

葡萄糖攝取增高是胰腺癌代謝重編程的重要特征之一，由介導葡萄糖順梯度異化擴散的GLUT家族和介導葡萄糖逆濃度梯度主動攝取的SGLT 家族介導。SGLT1 是由SLC5A1 編碼的，本研究分析TCGA 中的數據發現，SLC5A1 在胰腺癌組織中的表達顯著高于正常胰腺組織，遺憾的是本研究未能有臨床樣本進行進一步的組織學驗證，但這一結果與其他研究結果一致［8-9］，均提示其可能作為潛在治療靶點，有待后續進一步研究。

本研究進行GO 分析發現，大多數與SLC5A1相關的基因位于細胞膜和細胞核，負責蛋白和離子的結合，參與細胞生物功能、代謝及應激反應調節。利用KEGG 分析發現，SLC5A1 高表達除與葡萄糖攝取信號通路呈正相關，也與糖酵解信號通路正相關。糖酵解改變被認為是胰腺癌的主要代謝改變。許多糖酵解酶與PDAC 預后不良有關，而通過遺傳學途徑或用藥抑制糖酵解關鍵因子如己糖激酶2（hexokinaseⅡ，HK2）、磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase-1，PFK1)和乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）等已被證明能抑制胰腺癌惡性程度。最近，糖酵解增強還被發現與胰腺癌對吉西他濱喪失敏感性有關［10］。此外，本研究還發現SLC5A1 高表達與胰腺分泌、青少年的成年型糖尿病發病的信號通路激活呈正相關。2 型糖尿病患者并發腫瘤的風險增加，其中胰腺癌的風險增加了1.5～2.0 倍［11］，合并糖尿病的胰腺癌患者的死亡率顯著高于無糖尿病的患者［1］。此外，患有糖尿病的胰腺癌患者的腫瘤常較大，中位生存期短［13］。高胰島素血癥和高糖已被證明能促進胰腺癌的增殖、上皮-間充質轉換及轉移潛能［5］。SLC5A1 表達與葡萄糖攝取、糖酵解等信號通路的正相關提示其所編碼的SGLT1 可能參與胰腺癌發生、進展的機制。通過對SGLT1 的抑制有望降低腫瘤對葡萄糖的吸收，進而抑制胰腺癌的代謝、生長，具有臨床前景。

胰腺癌是胰源性糖尿病的重要病因，一項對PDAC 患者的對照研究發現，高血糖出現可能早于PDAC 診斷，提示新發糖尿病可作為胰腺癌的早期預警指標［11］。同時，靶向高血糖也可能有利于胰腺癌防治，經典降糖藥物二甲雙胍已被證明與PDAC合并糖尿病患者生存延長有關，而現今SGLT2 抑制劑及部分SGLT1 及SGLT2 雙抑制劑被作為降糖藥物廣泛應用于臨床［14］。此類藥物對糖尿病患者心衰及慢性腎臟病的改善作用確切，具有減重、低血糖風險低等優勢［11］，被美國、歐洲及我國等國家的2 型糖尿病指南推薦［15-17］。與慢性胰腺炎導致的胰源性糖尿病相比，胰腺癌相關胰源性糖尿病的胰島素水平相對較高，且外周胰島素抵抗更為顯著［18］。如SGLT1 及SGLT2 雙抑制劑對胰腺癌有抑制作用，那么在胰腺癌所致胰源性糖尿病患者中應用此類藥物有望達到降糖及抗腫瘤的雙重效果。

精準治療是腫瘤治療的重要發展趨勢。PDAC 具有高度異質性，最近的大規模轉錄分析將其劃分為不同亞型，每種亞型表現為不同臨床特征及代謝特征［11］。本研究分析發現，SLC5A1 的表達與胰腺祖細胞型和ADEX 型胰腺癌的關系更為密切，在胰腺祖細胞型胰腺癌中SLC5A1 的表達與FOXA3、HNF1A、FOXA2、HNF1B、PDX1、HNF4G、HNF4A 及HES1 表達均呈正相關，其大多與肝臟及胰島β 細胞的調節相關；同時，SLC5A1 的表達與ADEX 型胰腺癌相關基因中的INS、NR5A2、PRSS3 表達呈正相關。NR5A2 調控炎癥基因的表達，增加胰腺癌的風險［19］；PRSS3 在胰腺癌等消化道腫瘤中高表達，促進人胰腺癌腫瘤的生長與轉移，認為其可能在腫瘤的進展過程中參與了腫瘤的侵襲與轉移［20］，同時，有研究表明在結直腸癌患者中PRSS表達水平與癌細胞對西妥昔單抗的敏感性呈顯著負相關［20］，提示在上述亞型胰腺癌中抑制SLC5A1 可能達到更好的效果，這一發現需要后續進一步的研究以探討其作用的靶點。

綜上所述，本研究基于TCGA 胰腺癌數據分析發現SLC5A1 在胰腺癌中高表達，其高表達與葡萄糖攝取、糖酵解、胰腺分泌的基因信號通路呈正相關；SLC5A1 高表達與胰腺祖細胞型及ADEX 胰腺癌型密切相關，有可能成為胰腺癌代謝治療的新靶點。