芽孢桿菌(Bacillus)及其復(fù)合粘土對典型赤潮生物的去除作用研究*

鐘雨霞 俞志明 劉姍姍 曹西華 宋秀賢

芽孢桿菌()及其復(fù)合粘土對典型赤潮生物的去除作用研究*

鐘雨霞1, 2, 3, 4俞志明1, 2, 3, 4①劉姍姍1, 2, 3, 4曹西華1, 2, 3, 4宋秀賢1, 2, 3, 4

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室 山東青島 266237; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071)

有害赤潮對海洋生態(tài)環(huán)境和沿海經(jīng)濟危害巨大, 如何安全、有效地治理有害赤潮非常重要。文章考察了幾種常見芽孢桿菌對近海典型赤潮生物——東海原甲藻()的去除作用, 發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌()對其去除作用最強。進一步考察解淀粉芽孢桿菌對不同赤潮生物的去除作用, 發(fā)現(xiàn)該芽孢桿菌對米氏凱倫藻()和赤潮異彎藻()的去除作用高于東海原甲藻。在此基礎(chǔ)上, 將解淀粉芽孢桿菌與高嶺土復(fù)合, 研究了微生物復(fù)合粘土對典型赤潮生物的去除效果。結(jié)果表明, 解淀粉芽孢桿菌與高嶺土復(fù)合后, 能夠有效促進該菌的生長, 進而提升了其對赤潮生物的去除能力。文章對芽孢桿菌及其復(fù)合粘土去除赤潮生物的機制進行了分析和探討, 為進一步發(fā)展和優(yōu)化改性粘土治理赤潮技術(shù)體系提供了重要參考。

芽孢桿菌; 赤潮生物; 赤潮治理; 微生物復(fù)合粘土

赤潮是指由于海洋中微型浮游生物快速增殖或聚集, 導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能破壞的一種生態(tài)異常現(xiàn)象(俞志明等, 2019)474。赤潮暴發(fā)會破壞近海生態(tài)環(huán)境, 造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大損失, 嚴重制約海洋經(jīng)濟發(fā)展(Wang, 2021; Zingone, 2021)。2012年在福建沿海發(fā)生了以米氏凱倫藻為優(yōu)勢種的有毒赤潮, 導(dǎo)致大量養(yǎng)殖鮑魚死亡, 直接經(jīng)濟損失達20億元, 成為我國赤潮災(zāi)害有記錄以來造成經(jīng)濟損失最嚴重的一次近海赤潮(李雪丁, 2021)。隨著全球氣候變暖、近海富營養(yǎng)化加劇, 有害赤潮呈現(xiàn)全球擴張態(tài)勢, 危害范圍、程度逐年增加(Fu, 2008; 于仁成等, 2016; Gu, 2021)。因此, 尋求更有效、更安全的赤潮治理方法愈顯重要。

目前, 有害赤潮常見的治理方法主要分為物理、化學(xué)、生物等方法(Prasath, 2021)。其中, 利用溶藻細菌防治赤潮是一個研究熱點(Jeong, 2019)。近年來, 報道具有溶藻作用的細菌主要包括交替單胞菌()(Shi, 2018)72、假交替單胞菌()(Lyu, 2019)、弧菌() (Zhang, 2014)、芽孢桿菌(Bedoshvili, 2021)等。其中, 芽孢桿菌相較于其他溶藻細菌, 不僅具備能形成芽孢、穩(wěn)定性高等優(yōu)點, 而且具有改善水質(zhì)、提高水產(chǎn)動物免疫力等作用, 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)制劑(蔡紅丹等, 2021; 雷新雨等, 2021)。由此可見, 芽孢桿菌具有除藻、改善水質(zhì)的雙重作用, 有望作為有益除藻菌被應(yīng)用于赤潮治理中。但是, 迄今為止有關(guān)芽孢桿菌對有害赤潮生物的去除作用研究鮮有報道。

改性粘土治理赤潮技術(shù)主要是利用粘土顆粒與赤潮生物間的絮凝作用, 使赤潮生物沉降至水底、失活, 從而達到消除赤潮的目的(俞志明等, 2019)480。該技術(shù)具有治理效率高、成本低、應(yīng)急性強、環(huán)境友好等優(yōu)點, 被廣泛應(yīng)用于近海赤潮治理(Yu, 2017)。如果能將應(yīng)急性強的改性粘土方法與具有除藻、改善水質(zhì)雙重作用的芽孢桿菌聯(lián)合使用, 發(fā)揮各自的優(yōu)點, 有望開發(fā)出更具特色的赤潮治理技術(shù)。為此, 本文研究了幾種常見芽孢桿菌對近海典型赤潮生物的去除作用, 篩選出去除赤潮生物效果較好的解淀粉芽孢桿菌, 嘗試將其與粘土進行復(fù)合, 探討了該復(fù)合體系對典型赤潮生物的去除作用與主要影響因素, 為進一步發(fā)展和優(yōu)化改性粘土治理赤潮技術(shù)體系提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的高嶺土購自印度尼西亞BINTANG PUSPITA BUMIDWIPA公司, 蒙脫土、膨潤土購買自阿拉丁公司。

實驗所用我國近海典型赤潮生物種東海原甲藻、赤潮異彎藻和米氏凱倫藻, 均取自中國科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室赤潮藻種庫。將指數(shù)生長期的藻液分別接種在L1培養(yǎng)基中, 在(20±1) °C、光照強度為72 μmol photons/(m2·s)、光暗比12 h︰12 h的條件下培養(yǎng)。

本研究所用的芽孢桿菌均來自青島根源生物技術(shù)有限公司, 為固體粉末態(tài)。稱取0.1 g/L菌粉經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后, 利用LB固體培養(yǎng)基平板劃線分離純化并進行鑒定, 得到4株純化后的芽孢桿菌, 分別為枯草芽孢桿菌()、短小芽孢桿菌()、蠟樣芽孢桿菌()和解淀粉芽孢桿菌(表1)。用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)上述獲得的芽孢桿菌, 接種量為106cells/mL, 于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(30 °C, 200 r/min)培養(yǎng)24 h生長至穩(wěn)定期, 用于實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物復(fù)合粘土的制備 稱取一定質(zhì)量的粘土于250 mL錐形瓶中, 利用高壓蒸汽鍋在121 °C下滅菌30 min后, 置于紫外燈下滅菌20 min, 冷卻至室溫。在LB液體培養(yǎng)基中加入無菌粘土, 配制成每升含有25 g粘土的新的培養(yǎng)基, 接種芽孢桿菌, 其初始密度為106cells/mL, 置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱(30 °C, 200 r/min)中震蕩培養(yǎng)(熟化)一定時間, 得到微生物復(fù)合粘土。

表1 4株實驗所用芽孢桿菌16S rDNA或16S rRNA基因序列比對

Tab.1 Comparison of 16S rDNA or 16S rRNA gene sequences of 4 different strains of Bacillus used in the experiment

按照上述方法, 分別制備出不同種類粘土(高嶺土、蒙脫土、膨潤土)的微生物復(fù)合粘土, 以及不同熟化時間(0、8、12、24 h)的微生物復(fù)合粘土。

1.2.2 微生物及其復(fù)合粘土去除赤潮生物實驗

(1) 赤潮生物去除率的計算方法

赤潮生物去除實驗主要是將一定量的除藻材料(微生物、微生物復(fù)合粘土等)添加到赤潮藻液中, 處理一定時間后觀察添加除藻材料前后上層藻液中藻細胞密度的變化, 其對赤潮生物的去除作用通常用去除率表示(劉姍姍等, 2021)1171:

去除率(單位: %)=(1-實驗組葉綠素活體熒光值/

對照組葉綠素活體熒光值)×100, (1)

(2) 微生物除藻實驗

不同芽孢桿菌除藻實驗: 取50 mL指數(shù)生長中后期的東海原甲藻藻液于50 mL比色管中, 實驗所用藻密度見表2。實驗分為對照組與實驗組, 每組設(shè)置3個平行; 在實驗組中加入生長穩(wěn)定期的芽孢桿菌發(fā)酵液, 使其在藻液中的密度分別為2、3、4×106cells/mL, 顛倒混勻后, 置于常規(guī)培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng), 于24 h取樣, 測定葉綠素活體熒光值, 計算去除率。

解淀粉芽孢桿菌對不同赤潮生物的去除實驗: 取50 mL指數(shù)生長中后期的藻液于50 mL比色管中, 實驗所用赤潮生物種類及對應(yīng)藻密度見表2。實驗分為對照組與實驗組, 每組設(shè)置3個平行; 在實驗組中加入生長穩(wěn)定期的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液, 使其在藻液中的密度為106cells/mL, 顛倒混勻后, 置于常規(guī)培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng), 于24、36、48 h取樣, 測定葉綠素活體熒光值, 計算去除率。

菌體、發(fā)酵上清液和培養(yǎng)基對赤潮生物的去除實驗: 將生長穩(wěn)定期(菌密度約為5×108cells/mL)芽孢桿菌發(fā)酵液離心(3 824×, 10 min)得到沉淀和上清液: 將沉淀用無菌生理鹽水洗滌3次, 最后等體積重懸, 得到菌體; 將上清液用0.22 μm的針頭濾膜過濾3次得到無菌發(fā)酵上清液。取50 mL處于指數(shù)生長期中后期的藻液置于比色管中, 實驗所用赤潮生物種類及對應(yīng)藻密度見表2。實驗分為對照組和實驗組, 每組設(shè)3個平行; 在實驗組中分別加入發(fā)酵液、菌體及發(fā)酵上清液(發(fā)酵上清液添加體積與發(fā)酵液添加體積相同), 在發(fā)酵液和菌體實驗組中, 解淀粉芽孢桿菌在藻液中的密度為106cells/mL, 顛倒混勻后, 置于常規(guī)培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng), 于24 h取樣, 測定葉綠素活體熒光值, 計算去除率。

表2 除藻實驗中赤潮生物的初始密度

Tab.2 The initial density of red tide organisms in the experiment of removing algae

(3) 微生物復(fù)合粘土除藻實驗

取50 mL指數(shù)生長中后期的東海原甲藻藻液于50 mL比色管中, 實驗所用藻密度見表2。實驗分為對照組與實驗組, 每組設(shè)置3個平行; 實驗組分別加入一定量的微生物復(fù)合粘土、未添加粘土的微生物(與微生物復(fù)合粘土懸濁液添加體積相同)、高嶺土(與微生物復(fù)合粘土添加粘土濃度相同), 顛倒混勻后, 置于常規(guī)培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng), 于24 h取樣, 測定葉綠素活體熒光值, 計算去除率。

1.2.3 解淀粉芽孢桿菌對赤潮藻細胞裂解的影響

取1 mL指數(shù)生長中后期的藻液(實驗用藻同1.2.2節(jié))于24孔板中, 加入一定體積生長穩(wěn)定期的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液, 使解淀粉芽孢桿菌在藻液中的密度為106cells/mL, 混勻后靜置培養(yǎng), 于不同時間點用倒置顯微鏡觀察芽孢桿菌對赤潮藻細胞裂解的影響。

1.3 細菌計數(shù)方法

微生物除藻實驗: 采用流式細胞儀(BD FACS Calibur, 美國)進行測定。用SYBR Green I染色劑(體積比1︰10 000)染色樣品, 避光放置15 min后, 使用流式細胞儀進行檢測, 依據(jù)前向散射信號(forward scatter, FSC)、側(cè)向散射信號(side scatter, SSC)、DNA與SYBR Green I結(jié)合后經(jīng)激發(fā)所產(chǎn)生的綠色熒光信號(FL1, 波長為515～545 nm)等參數(shù), 利用絕對計數(shù)管(BD Trucount tubes, 美國)確定細菌密度。

微生物復(fù)合粘土除藻實驗: 均采用稀釋涂布平板法計算細菌密度。吸取發(fā)酵液(微生物復(fù)合粘土組、未添加粘土的微生物組) 1 mL, 加入到9 mL無菌生理鹽水中, 在渦旋振蕩器上震蕩5 s, 得到10-1稀釋液, 再從10-1稀釋液中取1 mL, 加入到9 mL無菌生理鹽水中, 得到10-2稀釋液, 諸如此類, 稀釋至10-6、10-7, 取10-6、10-7稀釋倍數(shù)的稀釋液0.1 mL涂布到LB固體平板上, 放置于30 °C恒溫培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)1 d, 至清晰菌落長出, 計算菌落數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用FlowJo10.6.2軟件進行細菌數(shù)量的讀取和分析, 運用Excel和Origin 2019對數(shù)據(jù)進行處理及繪圖。使用 SPSS 26軟件ANOVA、LSD 功能對數(shù)據(jù)進行方差分析, 對各實驗與對照組均值之間的差異性進行顯著性檢驗, 結(jié)果表示為平均值±標準偏差。

2 結(jié)果

2.1 芽孢桿菌對典型赤潮生物的去除作用

2.1.1 不同芽孢桿菌對東海原甲藻的去除作用 本文選用4株水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的芽孢桿菌, 考察了不同密度芽孢桿菌對東海原甲藻的去除作用。結(jié)果表明, 4株芽孢桿菌都對東海原甲藻具有一定去除作用, 且隨著芽孢桿菌添加量的增加, 去除作用加強(圖1)。其中, 解淀粉芽孢桿菌的去除作用最強; 相同添加密度下, 其去除率顯著高于其他3株芽孢桿菌(< 0.05)。隨著解淀粉芽孢桿菌添加量的增加, 去除作用增強: 當(dāng)添加量約為2×106cells/mL時, 添加24 h后的去除率為40%左右; 當(dāng)添加量增加至4×106cells/mL時, 去除率升至60%。因此, 本文以解淀粉芽孢桿菌為實驗對象, 進一步研究了其對其他赤潮生物(赤潮異彎藻和米氏凱倫藻)的去除作用。

圖1 4株芽孢桿菌對東海原甲藻的去除率(24 h)

2.1.2 解淀粉芽孢桿菌對不同赤潮生物的去除作用

(1) 解淀粉芽孢桿菌對不同赤潮生物的去除率

當(dāng)解淀粉芽孢桿菌添加量為106cells/mL, 24 h后對米氏凱倫藻、赤潮異彎藻和東海原甲藻的去除率分別為80%、60%和40% (圖2), 48 h后對米氏凱倫藻和對赤潮異彎藻的去除率達到90%, 而對東海原甲藻的去除率僅為70%左右。由此可見, 相同添加量下, 解淀粉芽孢桿菌對赤潮異彎藻和米氏凱倫藻的去除率高于東海原甲藻。

圖2 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對不同赤潮生物的去除率

注: 解淀粉芽孢桿菌的添加量為106cells/mL

(2) 解淀粉芽孢桿菌對赤潮生物細胞作用的顯微觀察

不同赤潮生物細胞在解淀粉芽孢桿菌作用下的形態(tài)變化如圖3所示。實驗組在菌密度為106cells/mL處理24 h后, 赤潮生物細胞的細胞膜遭到破壞, 細胞變形、裂解, 內(nèi)容物流出(圖3a, 3b), 與對照組赤潮生物細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整形成了鮮明對比。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 發(fā)酵液處理24 h后, 約50%赤潮異彎藻和米氏凱倫藻的藻細胞裂解, 視野中細菌數(shù)量明顯增加; 而在東海原甲藻實驗組中, 雖然也觀察到細菌數(shù)量明顯增加, 但僅有大約30%的藻細胞裂解, 大部分藻細胞出現(xiàn)“脫殼”現(xiàn)象, 觀察到大量只有細胞壁的空殼(圖3c)。本研究首次發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能夠使東海原甲藻細胞出現(xiàn)“脫殼”現(xiàn)象, 其主要原因可能是解淀粉芽孢桿菌破壞了東海原甲藻的巨胞生長帶(megacytic growth band)。由于巨胞生長帶位于東海原甲藻的兩個主板之間, 是細胞生長分裂的區(qū)域(Shi, 2018)77, 由此導(dǎo)致內(nèi)容物流出, 留下細胞壁碎片, 形成“空殼”。

圖3 添加解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液后對赤潮藻細胞裂解的影響

注: a..; b..; c..

(3) 菌體、發(fā)酵上清液和培養(yǎng)基對赤潮生物的去除作用辨析

解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液包含了菌體、培養(yǎng)基和細菌分泌物等多種組分, 為了辨析該發(fā)酵液中的主要除藻組分, 本文分別研究了解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液、菌體、發(fā)酵上清液和培養(yǎng)基等各組分對赤潮生物的去除作用。將各組分分別添加至赤潮藻液24 h, 結(jié)果如圖4所示: 發(fā)酵液對東海原甲藻去除率為40%, 其中貢獻較大的是濾液, 達到34%, 菌體和培養(yǎng)基對藻細胞的去除作用相對較弱。該現(xiàn)象在米氏凱倫藻和赤潮異彎藻實驗中更加明顯: 發(fā)酵液對米氏凱倫藻和赤潮異彎藻的去除率分別為88%、67%, 其中濾液的去除率分別達到86%和60%。由此可見, 發(fā)酵液的主要除藻作用來自于濾液, 而濾液主要由培養(yǎng)基和細菌分泌物組成, 在本實驗條件下前者的去除作用不明顯, 因此可以推斷細菌分泌物應(yīng)是發(fā)酵液去除赤潮生物的主要有效組分。

圖4 不同處理組對赤潮生物的去除率(24 h)

注: 添加5×108cells/mL的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液150 μL, 實驗所用藻液體積為50 mL

2.2 微生物復(fù)合粘土對赤潮生物的去除作用

2.2.1 微生物復(fù)合粘土對東海原甲藻的去除作用 將粘土與解淀粉芽孢桿菌按照1.2.1節(jié)制備成微生物復(fù)合粘土, 其對東海原甲藻的去除作用如圖5所示。結(jié)果表明, 解淀粉芽孢桿菌與高嶺土復(fù)合后能顯著提升其去除率(<0.05), 與僅添加微生物、粘土處理組相比, 去除率分別提升5%～20%、37%～54%; 且在較低的添加濃度下, 微生物復(fù)合粘土的提升作用更明顯。為進一步探討微生物復(fù)合粘土去除率提高的原因, 對解淀粉芽孢桿菌在微生物復(fù)合粘土懸濁液中的密度進行測定。結(jié)果如表3所示, 解淀粉芽孢桿菌與高嶺土復(fù)合熟化24 h后, 其細菌密度是未添加粘土組細菌密度的2倍, 說明高嶺土有效促進了解淀粉芽孢桿菌的生長, 進而提升了對東海原甲藻的去除作用。

圖5 微生物與粘土復(fù)合前后對東海原甲藻的去除率(24 h)

表3 微生物復(fù)合粘土前后添加到藻液中的細菌密度

Tab.3 Bacterial density of B. amyloliquefaciens fermentation broth before and after adding clay

注: 菌密度指添加到藻液后解淀粉芽孢桿菌密度, 實驗所用藻液體積為50 mL

2.2.2 粘土種類和熟化時間對微生物復(fù)合粘土去除赤潮生物的影響 由于粘土種類及熟化時間可能影響微生物復(fù)合粘土對赤潮生物的去除作用, 本文分別考察了不同種類粘土及熟化時間對微生物復(fù)合粘土去除赤潮生物的影響(圖6)。

如圖6a所示, 改變微生物復(fù)合粘土中的粘土種類(蒙脫土、高嶺土、膨潤土)對其去除東海原甲藻的影響不大, 去除率均為50%左右。前面(2.2.1)實驗結(jié)果表明, 高嶺土能夠有效促進解淀粉芽孢桿菌的生長, 圖6b的結(jié)果進一步證明其他種類的粘土也具有這種促進作用, 該促進作用與實驗選用的粘土種類差別不大。

選取實驗室常用的粘土材料高嶺土, 進一步研究了微生物復(fù)合粘土不同熟化時間對去除赤潮生物的影響。結(jié)果顯示隨著熟化時間的增加, 微生物復(fù)合粘土的去除率也隨之增加; 熟化時間為24 h時, 添加0.075 g/L微生物復(fù)合粘土的去除率達到51.93% (圖6c)。與此同時, 測定了不同熟化時間微生物復(fù)合粘土懸濁液與未加粘土組微生物懸濁液中芽孢桿菌的密度, 結(jié)果如圖6d所示: 熟化時間為8 h時微生物復(fù)合粘土組的細菌密度約為8.3×108cells/mL, 而未加粘土組微生物懸濁液的細菌密度約4.2×108cells/mL; 當(dāng)熟化時間為24 h時, 細菌密度達到本實驗范圍中的最大值, 微生物復(fù)合粘土組懸濁液的細菌密度約為1.28×109cells/mL, 未加粘土組微生物懸濁液中的細菌密度約為6.5×108cells/mL。上述結(jié)果進一步表明, 粘土可以顯著提升解淀粉芽孢桿菌的生物量(<0.05), 這也是導(dǎo)致微生物復(fù)合粘土隨著熟化時間增加, 去除率提高的主要原因。

3 討論

3.1 芽孢桿菌去除赤潮生物的機制分析

前期研究曾表明芽孢桿菌是一類具有溶藻功能的細菌。例如, 程捷(2021)研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸芽孢桿菌()通過分泌小分子代謝物質(zhì)來裂解銅綠微囊藻()藻細胞, Chen等(2021)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌B1分泌的次黃嘌呤能夠造成赤潮異彎藻產(chǎn)生氧化應(yīng)激, 使得藻細胞膜脂質(zhì)過氧化, 導(dǎo)致藻細胞死亡。但是有關(guān)解淀粉芽孢桿菌對有害藻赤潮生物的除藻效果及作用機理尚未見有研究報道。

圖6 不同粘土種類與熟化時間對東海原甲藻去除率的影響(24 h)

注: a. 解淀粉芽孢桿菌與不同類型粘土熟化24 h對東海原甲藻的去除率(24 h) ; b. 與不同類型粘土熟化24 h后的微生物密度; c. 與高嶺土熟化不同時間對東海原甲藻的去除率(24 h); d. 與高嶺土熟化不同時間后的微生物密度(添加到藻液中的粘土濃度0.075 g/L)

通常, 溶藻細菌可通過直接作用和間接作用兩種方式抑制藻細胞的生長。直接作用是指細菌直接攻擊藻細胞, 使藻細胞裂解死亡(Imai, 2021)。比如熒光假單胞菌()粘附在硅藻類的冠盤藻()細胞壁上, 侵蝕其細胞壁, 使其裂解失活(Jung, 2008)。間接作用是指細菌通過營養(yǎng)競爭、群體感應(yīng)(Quorum sensing)、分泌胞外產(chǎn)物等方式來抑制藻細胞生長或者裂解藻細胞(Meyer, 2017)883。目前發(fā)現(xiàn)的大部分細菌的溶藻方式是通過分泌胞外活性物質(zhì)產(chǎn)生溶藻作用, 這些胞外活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)多種多樣: 從極性來看, 涵蓋了從極性很高的氨基酸衍生物到極性較低的脂肪酸; 從分子量來看, 有分子量在500 g/mol以下的小分子代謝物、中等分子量物質(zhì)類似肽、還有類似酶這種kDa以上的大分子類物質(zhì), 其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得分析某類細菌具體起作用的溶藻物質(zhì)十分困難(Meyer, 2017)887。迄今研究發(fā)現(xiàn), 溶藻細菌分泌的溶藻活性物質(zhì)主要包括生物堿類、酶類、氨基酸衍生物、多肽蛋白質(zhì)類、聚酮化合物類等。不同的活性物質(zhì)導(dǎo)致藻細胞死亡的作用方式也不同(Mayali, 2008; Zheng, 2013; Zhang, 2016), 目前大部分的研究都將這些胞外活性物質(zhì)產(chǎn)生的溶藻作用歸為間接作用。

本研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌的濾液在去除赤潮生物中發(fā)揮了主要作用, 說明解淀粉芽孢桿菌去除赤潮生物以間接作用為主, 可能是解淀粉芽孢桿菌的代謝物質(zhì)導(dǎo)致典型赤潮生物的死亡。王繼華等(2017)的研究結(jié)果表明, 解淀粉芽孢桿菌在生長代謝過程能夠產(chǎn)生多種代謝物質(zhì), 比如抗菌蛋白、脂肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類和聚酮化合物等, 這些分泌物質(zhì)具有抗菌作用。本研究結(jié)果進一步表明, 這些分泌物質(zhì)除了抗菌作用外, 還具有去除赤潮生物的作用。由于解淀粉芽孢桿菌廣泛存在于自然海域, 易于培養(yǎng)和生產(chǎn), 所以被廣泛應(yīng)用于抑菌劑及水產(chǎn)養(yǎng)殖等相關(guān)領(lǐng)域(張維娜等, 2017; Woldemariamyohannes, 2020)。本研究結(jié)果表明其在赤潮防控方面也可發(fā)揮重要作用, 進一步提升和拓展了芽孢桿菌的生態(tài)價值和環(huán)保功能, 具有重要的意義。

3.2 芽孢桿菌復(fù)合粘土去除赤潮生物的機制分析

如前所述, 利用溶藻細菌控制有害赤潮是目前人們關(guān)注的一個研究熱點(石新國, 2021)。盡管已取得很多進展, 但在實際應(yīng)用中仍存在效率低、時效長、難以大規(guī)模應(yīng)用等問題(劉萍等, 2016)。因此, 與其他除藻技術(shù)聯(lián)合使用、優(yōu)勢互補是解決上述問題的重要途徑。粘土絮凝法是一種利用絮凝沉降原理快速去除水體中赤潮生物的方法, 而溶藻細菌治理赤潮只能依靠其自然沉降。如果將粘土方法與溶藻細菌相結(jié)合, 從原理上講可優(yōu)勢互補, 能夠解決單獨使用溶藻細菌時存在的問題。

本研究結(jié)果證明了兩者結(jié)合的可能性和可行性, 并且發(fā)現(xiàn)隨著熟化時間的增加, 溶藻細菌生物量增加, 其去除率也提高, 微生物復(fù)合粘土的去除率與微生物密度呈正相關(guān)關(guān)系(圖7)。

圖7 微生物復(fù)合粘土對東海原甲藻的去除率與微生物復(fù)合粘土中細菌密度的相關(guān)性

我們前期對EM菌的研究表明, 無機改性粘土能局部富集EM菌及其分泌的溶藻物質(zhì), 提升該菌的局部密度, 從而增強EM菌對東海原甲藻的去除作用(劉姍姍等, 2021)1178。與之類似, 本研究所使用的微生物復(fù)合粘土一方面通過粘土顆粒的絮凝作用聚集更多的赤潮藻細胞、快速沉降; 另一方面, 粘土顆粒通過與芽孢桿菌熟化、培養(yǎng), 表面富集了大量芽孢桿菌, 顯著增強了對赤潮生物細胞的破壞作用。由此可見, 解淀粉芽孢桿菌復(fù)合粘土通過促進芽孢桿菌生長、富集赤潮生物、提升局部滅藻效果是其展現(xiàn)較高去除率的主要原因。此外, 微生物與粘土復(fù)合后能提升對有機物的降解能力, 加速對碳氫化合物的有效降解(Sarkar, 2012; Biswas, 2017), 對赤潮發(fā)生后導(dǎo)致有機質(zhì)較高的惡劣環(huán)境具有較好的改善作用。由此可見, 微生物復(fù)合粘土是對我們前期提出的改性粘土治理赤潮技術(shù)的進一步拓展, 具有顯著而廣闊的發(fā)展前景。

4 結(jié)論

(1) 解淀粉芽孢桿菌可以通過代謝產(chǎn)物破壞典型赤潮生物的細胞壁和細胞膜, 導(dǎo)致赤潮藻細胞內(nèi)容物流出、藻細胞死亡, 從而對赤潮生物產(chǎn)生去除作用。研究結(jié)果表明, 解淀粉芽孢桿菌對米氏凱倫藻和赤潮異彎藻的去除效果高于東海原甲藻。

(2)解淀粉芽孢桿菌與高嶺土復(fù)合后, 其生物量比未添加粘土組明顯增加。在此基礎(chǔ)上制備的解淀粉芽孢桿菌復(fù)合粘土對東海原甲藻的去除效果明顯提升, 主要是由于該復(fù)合粘土可以促進芽孢桿菌生長、富集赤潮生物、提升局部滅藻效果所致。

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REMOVAL EFFECT OF TYPICAL RED TIDE ORGANISMS WITHAND MICROBIAL MODIFIED CLAY

ZHONG Yu-Xia1, 2, 3, 4, YU Zhi-Ming1, 2, 3, 4, LIU Shan-Shan1, 2, 3, 4, CAO Xi-Hua1, 2, 3, 4, SONG Xiu-Xian1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Harmful red tides cause serious damage to the marine ecosystem and marine economy. It is very important to seek effective and safe technology to control harmful red tides. The removal efficiency ofand microbial modified clay on typical red tide organisms was studied. Results show thathad the highest removal efficiency onamong several common.had a higher removal efficiency onandthanIt was found that kaolin could effectively promote the growth of bacteria, thereby enhancing the ability to remove red tide organisms. The mechanism of algae removal byand microbial modified clay was discussed. This study provided an important reference for further development and optimization of red tide control technology with modified clay.

; red tide organisms; red tide control technology; microbial modified clay

X55

10.11693/hyhz20220100015

*山東省重大科技創(chuàng)新工程項目, 2019JZZY010808號; 2019年度“泰山學(xué)者攀登計劃”項目; 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室“十四五”重大項目, 2021QNLM040001號。鐘雨霞, 碩士研究生, E-mail: 1441796306@qq.com

俞志明, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: zyu@qdio.ac.cn

2022-01-20,

2022-03-22