麻痹性貝毒在毛蚶體內的轉化過程研究*

林卓如 耿慧霞 唐文嬌, 5 于仁成, 2, 3, 4

麻痹性貝毒在毛蚶體內的轉化過程研究*

林卓如1, 3耿慧霞1唐文嬌1, 5于仁成1, 2, 3, 4①

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室 山東青島 266071; 3. 中國科學院大學 北京 100049; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071; 5. 中國海洋大學海洋生命學院 山東青島 266003)

麻痹性貝毒能夠在貝類體內累積, 威脅海產品消費者健康。在以往調查中, 多次在毛蚶()體內發現高含量的麻痹性貝毒, 但對于毛蚶體內麻痹性貝毒的轉化過程及其食品安全風險還缺乏認識。通過室內模擬實驗, 選擇太平洋亞歷山大藻()和鏈狀裸甲藻()作為產毒藻種, 研究了兩種有毒藻種所產麻痹性貝毒在毛蚶體內的轉化過程。結果表明, 毛蚶體內主要出現了三種麻痹性貝毒轉化過程, 一是R1位羥基的還原反應, 二是-磺酰氨甲?；惗舅豏4位磺酸基團的水解反應, 三是含羥基苯甲酸(hydroxybenzoate)基團的鏈狀裸甲藻毒素在R4位的水解反應。毛蚶體內麻痹性貝毒的生物轉化過程復雜, 對毛蚶毒性的影響具有一定的不確定性, 未來仍需要進一步深化毛蚶體內毒素累積、代謝、轉化過程的研究, 同時加強對毛蚶體內毒素含量的全面監測, 防范毛蚶可能導致的麻痹性貝毒中毒風險。

麻痹性貝毒; 毛蚶; 太平洋亞歷山大藻; 鏈狀裸甲藻; 鏈狀裸甲藻毒素; 毒素轉化

麻痹性貝毒中毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)是沿海地區常見的一類中毒事件, 多因消費者誤食含有麻痹性貝毒(paralytic shellfish toxins, PSTs)的貝類造成, 嚴重時可能導致死亡。麻痹性貝毒是一類神經毒素, 能夠與神經細胞的鈉離子通道結合, 阻斷信號傳導, 對人體產生毒害作用(Kao, 1965; Ritchie, 1977)。麻痹性貝毒中毒的典型癥狀包括肢體麻木、皮膚刺痛、惡心、嘔吐、發燒、肌肉麻痹等, 嚴重時可能出現呼吸衰竭和休克等(于仁成等, 2016)156。在海洋環境中, 麻痹性貝毒主要由甲藻產生, 常見的產毒甲藻包括亞歷山大藻屬()中的部分藻種(如太平洋亞歷山大藻.、鏈狀亞歷山大藻.、微小亞歷山大藻.等)、裸甲藻屬的鏈狀裸甲藻()和梨甲藻屬中的個別藻種(var.)。其中, 亞歷山大藻屬和裸甲藻屬的產毒藻種在我國近海較為常見(于仁成等, 2016)159～160。麻痹性貝毒通常累積在貝類中, 我國沿海地區曾多次發生過因食用染毒貝類導致的麻痹性貝毒中毒事件, 對消費者身體健康構成嚴重威脅(林燕棠等, 1999; 于仁成等, 2016156～157, 陳火榮, 2018)。

麻痹性貝毒是一類具有四氫嘌呤環結構的化合物(圖1), 已知毒素同系物近60種, 在不同位點取代基種類的差異會影響毒素成分的性質和毒性。在以往研究中, 通常根據R4位點取代基的差異, 將常見麻痹性貝毒分為3類:-磺酰氨甲酰基類毒素、氨基甲酸酯類毒素和脫氨甲?；惗舅?表1)。其中氨基甲酸酯類毒素的毒性最高, 而-磺酰氨甲酰基毒素由于R4基團過大, 影響與鈉離子通道的結合, 表現出最低的毒性(Leal, 2022)13。近年來, 在鏈狀裸甲藻中發現了一類新的羥基苯甲酸酯石房蛤毒素, 并依據產毒藻名稱將其命名為鏈狀裸甲藻毒素(toxins), 簡稱GC毒素(Negri, 2003)。這類毒素R4位點上的取代基為羥基苯甲酸基團。大部分麻痹性貝毒為水溶性毒素, 而GC毒素因其羥基苯甲酸基團而具有一定的脂溶性特征。GC毒素與小鼠腦神經細胞的鈉離子通道具有較強的結合能力, 說明其可能具有較高的毒性(Llewellyn, 2004)101。此外, 由于GC毒素具備一定的脂溶性, 研究者推測其在生物體內的保留時間會長于其他麻痹性貝毒, 可能會對消費者身體健康造成更大的危害(Llewellyn, 2004)103。

圖1 麻痹性貝毒結構

表1 不同種類麻痹性貝毒的結構

Tab.1 Substituents of different paralytic shellfish toxins

貝類在攝食麻痹性貝毒產毒藻后, 體內的麻痹性貝毒具有明顯的蓄積、轉化和排出過程, 進而影響貝類的毒性狀況。根據以往研究得到的認識, 貝體內麻痹性貝毒具有多類轉化過程, 根據其轉化條件可分為化學轉化過程和酶促轉化過程(Suzuki, 1998)。麻痹性貝毒R2與R3基團的差向異構化反應屬于典型的化學轉化過程, 由藻類中占據優勢的異構體逐漸轉化為貝類中占據優勢的異構體(Jaime, 2007)。此外,-磺酰氨甲?；惗舅厮猱a生氨基甲酸酯類毒素也是化學轉化過程, 該反應傾向于在酸性條件下發生(田華, 2009)。貝類體內發生的毒素酶促轉化過程主要是通過水解反應生成脫氨甲酰基類毒素, 包括氨甲酰基水解酶對氨基甲酸酯類毒素的水解以及磺氨甲?；饷笇?磺酰氨甲?；惗舅氐乃?Raposo, 2020)4。目前, 對于GC毒素在貝體內的轉化過程仍缺乏足夠的了解, 有研究認為GC毒素在貝體內也會通過酶促水解產生脫氨甲?；惗舅?Vale, 2008)191。貝類對于麻痹性貝毒的轉化具有明顯的種間差異, 扇貝和蛤對麻痹性貝毒的轉化過程較為強烈, 其體內的毒素組成與產毒藻存在較大差異; 牡蠣和貽貝對麻痹性貝毒的轉化相對較弱, 更多表現為毒素比例的變化(Botelho, 2020; 包振民等, 20214)。還有研究表明, 貝類攝食產毒藻后能夠將麻痹性貝毒快速代謝轉化為新型的低毒性M類毒素(Dell’Aversano, 2008; Li, 2012), 并將其快速排出體外, 以達到脫毒的目的。因此, 深入探究貝體內麻痹性貝毒的轉化過程, 解析不同貝類對毒素的轉化特征, 有助于準確評估貝體內麻痹性貝毒的致毒風險, 更好地防控麻痹性貝毒中毒事件。

毛蚶()廣泛分布于我國沿海地區, 是常見的海產經濟貝類。主要產區位于渤海和黃海海域, 包括渤海灣、遼東半島和黃海大陸架海域等(張福崇等, 2020)。到目前為止, 我國沿海尚未出現因食用毛蚶導致的麻痹性貝毒中毒事件。但是, 以往調查中發現毛蚶體內麻痹性貝毒含量可以達到較高水平, 在天津漢沽和河北秦皇島海域的毛蚶樣品中, 麻痹性貝毒毒性甚至超出農產品安全質量限量標準(柳陽, 2017)70, 極有可能導致中毒事件發生。目前對于毛蚶體內麻痹性貝毒的累積、轉化和排出過程還缺乏科學認識, 有必要通過科學研究深入了解毛蚶暴露于有毒藻后體內麻痹性貝毒的動態變化過程, 進而闡明其對毛蚶毒性的影響。對此, 本研究通過模擬實驗, 選擇太平洋亞歷山大藻(.)和鏈狀裸甲藻(.)作為典型產毒藻種, 研究了毛蚶體內麻痹性貝毒的轉化過程, 以期揭示毛蚶中麻痹性貝毒轉化特征和規律, 為防控麻痹性貝毒中毒事件提供基礎科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

實驗中用到的有機溶劑包括甲醇(色譜級, Merck, 德國)、乙腈(色譜級, Merck, 德國)、甲酸(色譜級,≥99%, 麥克林)、硝酸(工藝超純, 66.6%～68.0%, 國藥)、磷酸(優級純, 國藥)、鹽酸(優級純, ≥36%, 國藥)、乙酸(色譜級, ≥99.0%, 科密歐)、氨水(優級純, 25%～28%, 國藥)、四丁基磷酸二氫銨(≥99.00%, Fulka, 美國)、庚基磺酸鈉(Wako, 日本)、高碘酸H5IO6·2H2O(≥99.0%, Sigma, 美國)。實驗中使用的超純水由超純水機(Millipore Simplicity, 美國)制備。毒素標準物質(GTX1&4、GTX2&3、STX、NEO、dcGTX2&3、dcSTX、dcNEO、C1&2、GTX5、GTX6)購自加拿大國家研究院海洋生物科學研究所, 在有效使用期內使用。

1.2 實驗生物

實驗所用藻株包括太平洋亞歷山大藻(MEL2株)和鏈狀裸甲藻(MEL11株)。太平洋亞歷山大藻(以往通過形態學方法鑒定為塔瑪亞歷山大藻復合種.species complex, ATHK藻株)來自暨南大學, 分離自南海; 鏈狀裸甲藻于2017年分離自福建莆田近海, 并經形態學和分子生物學鑒定(Lin, 2022)。實驗用海水取自青島市匯泉灣, 經0.45 μm濾膜過濾后, 煮沸滅菌, 冷卻后加入到經過高溫滅菌的錐形瓶中, 按照L1培養基配方(Guillard, 1993)加入營養鹽、微量元素和維生素, 接入藻種后進行培養。太平洋亞歷山大藻培養溫度為18 °C, 光照強度為3 000 lx, 光暗循環為L: D=12 h: 12 h; 鏈狀裸甲藻培養溫度為20 °C, 光照條件同上。

實驗用毛蚶(.)采自山東青島近海, 殼長(4.50±0.27) cm, 殼寬(3.45±0.24) cm, 殼高(2.82±0.28) cm, 軟組織凈重(6.94±1.04) g。購入后先在實驗室內馴化, 期間持續通氣并每天更換培養海水。挑取馴化后健康活躍的毛蚶用于實驗, 每6只毛蚶分為1組, 培養于裝有3 L經0.22 μm濾膜過濾海水的燒杯中, 實驗期間持續通氣并定期更換海水。

1.3 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻的室內培養實驗

取一定量的太平洋亞歷山大藻培養液, 用10 μm篩網濃縮藻液中的藻細胞并置于一定量海水中混勻。取1 mL混勻后的藻液, 加入20 μL魯哥試劑(Lugol’s agent)固定, 在顯微鏡(Zeiss, Axio Vert A1, 德國)下計數藻細胞密度。量取一定體積的藻液, 在≤0.05 MPa壓力下抽濾至1.2 μm玻璃纖維濾膜(GF/C, Whatman, 直徑47 mm)上, 置于-20 °C冷凍保存, 用于麻痹性貝毒分析。將剩余藻液加入燒杯中, 通過加入滅菌海水調整亞歷山大藻初始密度至2 000 cells/mL, 每只毛蚶投喂量約為1.0×106藻細胞。實驗進行48 h, 分別于投喂毛蚶后的第2、4、6、8和10 h取燒杯中水樣10 mL, 加魯哥試劑固定后計數剩余亞歷山大藻細胞密度, 用于計算毛蚶實際攝食的藻細胞數量。分別于投喂前和投喂后的第1、2、4、8、12、24和48 h取毛蚶樣品, 解剖毛蚶并采集全部軟組織, 于-20 °C下冷凍保存, 統一進行麻痹性貝毒分析。

1.4 毛蚶攝食鏈狀裸甲藻的室內培養實驗

鏈狀裸甲藻的濃縮和取樣方法與1.3部分中太平洋亞歷山大藻的濃縮與取樣方法相同。鏈狀裸甲藻初始密度設置為400 cells/mL, 每只毛蚶投喂量約2.0×105藻細胞, 實驗進行96 h。分別于投喂后第2、4、6、8、10和12 h取燒杯中水樣10 mL, 魯哥試劑固定后計數剩余藻細胞密度, 用于計算毛蚶攝食藻細胞數量。分別于投喂毛蚶后的第2、4、8、12、24、48、72和96 h取毛蚶樣品, 解剖毛蚶并采集全部軟組織, 于-20 °C下冷凍保存, 統一進行麻痹性貝毒分析。

1.5 麻痹性貝毒分析

亞歷山大藻細胞及投喂亞歷山大藻的毛蚶樣品均采用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測法進行麻痹性貝毒分析, 毒素提取和分析過程參照柳陽(2017)37～42檢測方法進行。鏈狀裸甲藻及投喂鏈狀裸甲藻的毛蚶樣品, 因其中含有GC毒素成分, 均采用高效液相色譜-質譜聯用方法進行麻痹性貝毒分析, 毒素提取和分析過程如下。

1.5.1 鏈狀裸甲藻中毒素提取 將濾有藻細胞的玻璃纖維濾膜剪碎, 置于15 mL離心管中, 加入3 mL 0.05 mol/L醋酸溶液。使用渦旋振蕩器(IKA, MS1 Minishaker, 美國)混合均勻后, 在冰浴條件下使用超聲波細胞破碎儀(JY96-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機, 寧波新芝科器研究所, 國產)對藻類樣品進行破碎(設置功率為100 W, 每次處理2 s后靜置2 s, 持續處理5 min)。鏡檢確認藻細胞完全破碎后, 將離心管置于高速冷凍離心機(Sigma 3-16K, 德國)中, 8 000 r/min離心10 min, 取上清液待基質凈化。

1.5.2 毛蚶中麻痹性貝毒提取 冷凍的貝類組織在室溫下解凍后, 用組織勻漿機(IKA, T10BS25, 美國)勻漿, 取5 g混勻的貝組織, 置于15 mL聚丙烯離心管中, 加入5 mL 0.05 mol/L醋酸溶液, 使用渦旋振蕩器震蕩混合, 混勻樣品置于水浴鍋(DK-8D, 上海一恒, 國產)中煮沸約5 min, 自然冷卻至室溫后, 于高速離心機中8 000 r/min離心10 min, 取上清液待進行基質凈化。

1.5.3 提取液基質凈化 水溶性麻痹性貝毒提取: 使用甲醇-水交替活化固相萃取柱(Supelclean LC-18, 3 mL, Supelco, 美國)后, 將1 mL藻類或貝類提取液加入固相萃取柱中, 使用真空泵緩慢抽干(壓力≤20 kPa), 并將洗脫液收集于5 mL離心管中。再加入1.5 mL超純水洗脫柱上殘留的水溶性麻痹性貝毒, 緩慢抽干后, 與上一步洗脫液合并收集于5 mL離心管中。加入少量超純水將收集的洗脫液定容至2.5 mL。取1 mL洗脫液, 經0.22 μm濾膜過濾后上機分析。

GC毒素提取: 向上一步洗脫水溶性麻痹性貝毒后的固相萃取小柱, 加入0.5 mL 20%甲醇洗脫, 洗脫液收集于1.5 mL離心管中。再加入0.5 mL 80%甲醇洗脫, 洗脫液與上一步洗脫液合并收集于1.5 mL離心管中。加入少量超純水將收集的洗脫液定容至1 mL, 震蕩混勻后, 取1 mL洗脫液經0.22 μm有機相濾膜過濾后上機分析。

1.5.4 麻痹性貝毒的高效液相色譜-質譜聯用分析 參照Costa等(2015)2055～2058建立的方法進行麻痹性貝毒的液-質聯用分析。采用超高效液相色譜儀(UltiMate 3000, Thermo Fisher, 美國)配合三重四極桿線性離子阱質譜儀(Qtrap?-4500, AB Sciex, 美國)進行毒素分析, 所用色譜柱為酰胺鍵合硅膠色譜柱(TSK-gel Amide-80, 5 μm, 2.0 mm×250 mm, 日本)。流動相A為50 mmol/L甲酸水溶液(pH=2.6), 流動相B為含有50 mmol/L 甲酸的95%乙腈水溶液(pH=2.6), 采用梯度洗脫(表2), 流速 200 μL/min, 進樣量 2 μL,柱溫箱溫度30 °C, 樣品池溫度4 °C。以標準毒素對質譜儀的響應進行調諧并優化檢測參數。優化后的質譜參數如下: 電噴霧離子源進行離子化, 氣簾氣電壓20 V, 霧化氣電壓設置為Medium, 電噴霧電壓5 500(+) V, 離子源溫度550 °C, 加熱輔助電壓1和2分別為45 Pa和55 Pa, 碰撞室入口電壓為10 V, 碰撞室出口電壓為9 V, 電子倍增管電壓CEM為1 800 V。在此基礎上對去簇電壓和碰撞能參數進行調諧優化。由于GC毒素尚無標準品, 其去簇電壓和碰撞能參照Costa等(2015)2058提出的方法進行設置。采用正離子掃描模式下的多反應監測模式(multiple reaction monitoring, MRM)對毒素進行檢測, 優化后毒素離子對及去簇電壓和碰撞能設置見表3。在對無標準品的麻痹性貝毒進行分析時, 假定其與結構相近的其他有標毒素具有相同的質譜響應, 即C3、C4、GC1、GC2、GC3、GC4、GC5與GC6分別參照C1、C2、GTX2、GTX3、STX、GTX1、GTX4和NEO的標準品進行定量分析。

表2 液-質聯用法分析麻痹性貝毒的洗脫梯度

Tab.2 Elution gradient in paralytic shellfish toxin analysis by HPLC-MS

表3 麻痹性貝毒質譜檢測參數

Tab.3 Mass spectrometry detection parameters of paralytic shellfish toxins

續表

2 結果

2.1 太平洋亞歷山大藻與鏈狀裸甲藻產毒情況

本研究中太平洋亞歷山大藻產生的麻痹性貝毒主要包括GTX1&4、GTX5和C1&2等, 毒素比例從高到低依次為GTX4 (45.6%)、GTX1 (24.3%)、C1 (17.7%)、C2 (7.8%)和GTX5 (4.5%)(圖2a)。毒素含量約8.38 fmol/cell。鏈狀裸甲藻產生的水溶性毒素成分主要為GTX5、GTX6、C1、C2、C3、C4, 以及微量的dcSTX和dcGTX2&3, 約占毒素總量的59%; 脂溶性的GC毒素主要包括GC2、GC3、GC5和GC6以及微量的GC1(圖2b), 約占毒素總量的41%。各種水溶性毒素的比例從高到低依次為GTX6 (37.58%)、C2 (12.63%)、C4 (5.90%)、GTX5 (1.66%)、C1 (0.82%)、C3 (0.16%)、dcSTX (0.08%)和dcGTX2&3 (0.02%); 而GC毒素比例由高到低依次為GC5 (27.38%)、GC6 (6.38%)、GC3 (5.24%)和GC2 (2.16%), GC1毒素含量低于定量限。經統計計算, 該株藻種麻痹性貝毒的含量約為456 fmol/cell。

2.2 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻后體內麻痹性貝毒變化情況

投喂亞歷山大藻前, 毛蚶體內未檢出麻痹性貝毒。投喂8 h內毛蚶已幾乎完全濾食藻細胞, 12 h后水體內無剩余藻細胞。在投喂后第1 h內毛蚶體內即檢測到麻痹性貝毒, 含量為0.03 nmol/g。毒素含量在1～12 h內逐漸增加, 至12 h時達到峰值1.41 nmol/g (圖3a)。在此期間, 毛蚶毒性也逐步上升, 并在12 h達到最高值111 μg STXeq/kg。計算結果表明, 毛蚶幾乎將投喂的太平洋亞歷山大藻中全部毒素都攝入體內。此后, 毛蚶開始排出毒素, 毒素含量逐漸下降, 毒性也相應下降, 至48 h毒性下降到44 μg STXeq/kg。實驗過程中毛蚶的毒性變化與其體內毒素含量變化基本一致。

圖2 太平洋亞歷山大藻(a)與鏈狀裸甲藻(b)產毒狀況

圖3 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻(a)和鏈狀裸甲藻(b)后體內毒素含量與毒性變化情況

實驗期間毛蚶體內共檢測到4種麻痹性貝毒, 分別是GTX2、GTX3、C1、C2。其中GTX2、GTX3在亞歷山大藻中未檢出, 而亞歷山大藻中的GTX1、GTX4和GTX5在毛蚶中未檢出。毛蚶中最主要的毒素成分是C1和GTX2, C2和GTX3占比較低。實驗期間毛蚶體內C1占比逐漸下降, 而GTX2占比逐漸上升(圖4a)。

2.3 毛蚶攝食鏈狀裸甲藻后體內麻痹性貝毒變化情況

投喂鏈狀裸甲藻前, 毛蚶體內未檢出麻痹性貝毒。投喂鏈狀裸甲藻12 h內, 毛蚶幾乎完全濾食鏈狀裸甲藻細胞。利用液-質聯用法檢測毛蚶體內麻痹性貝毒的譜圖見圖5。毛蚶暴露于鏈狀裸甲藻中2 h后體內即可檢出麻痹性貝毒, 暴露后前4 h毛蚶體內毒素保持快速增加, 達到2.91 nmol/g, 毛蚶毒性達到149 μg STXeq/kg(圖3b)。此后毛蚶體內毒素總量雖然保持上升趨勢, 但上升速率明顯降低, 第24 h毒素含量達到最高水平3.18 nmol/g, 毒性也達到峰值207 μg STXeq/kg。據估算, 毛蚶未能將投喂的鏈狀裸甲藻中全部毒素攝入體內, 累積毒素總量約占鏈狀裸甲藻中毒素總量的24%。自24 h后, 毛蚶開始排出毒素, 體內毒素總量逐漸下降。

在攝入鏈狀裸甲藻后, 毛蚶體內檢出的水溶性麻痹性貝毒成分主要包括GTX5、GTX6、dcSTX、STX、C1&2、C3&4、GTX2&3和dcGTX2&3, 其中GTX2&3和STX在鏈狀裸甲藻中未檢出。毒素累積階段, 毛蚶體內GTX6占比最高, 且逐漸增加; 其次是dcSTX和GTX5(圖4b), dcSTX和dcGTX2&3占比也明顯高于鏈狀裸甲藻。在毒素排出階段, dcSTX逐漸成為毛蚶體內主要的水溶性毒素組分, 最高占比達到34%, 而GTX6所占比例逐漸下降。在鏈狀裸甲藻產生的麻痹性貝毒中, dcSTX所占比例極小, 但在毛蚶體內逐漸成為最主要的毒素成分。毛蚶體內的C1&2、C3&4、dcGTX2&3、GTX2&3和STX毒素含量較低, 占毒素總量的比例也較小。對脂溶性麻痹性貝毒的分析結果表明, 實驗過程中毛蚶體內GC毒素占比略低于鏈狀裸甲藻。實驗開始后4 h內, 毛蚶體內GC毒素含量逐漸增加, GC2是主要的脂溶性麻痹性貝毒成分, GC3含量略低于GC2(圖4b)。4 h后, GC毒素總量逐漸下降, GC3開始成為主要的毒素成分, 其次是GC2、GC5和GC6則含量較低。

圖4 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻(a)和鏈狀裸甲藻(b)后體內麻痹性貝毒占比變化情況

圖5 利用液-質聯用法分析毛蚶體內麻痹性貝毒的色譜圖

注: a: 水溶性麻痹性貝毒標準品色譜圖; b: 毛蚶樣品中水溶性麻痹性貝毒色譜圖; c: 毛蚶樣品中GC毒素色譜圖

3 討論

毛蚶是我國近海常見的貝類, 具有較高的經濟價值(陳辰, 2015)。本研究發現, 毛蚶在暴露于產毒藻后, 會快速累積麻痹性貝毒, 具備一定的毒素累積能力。在產毒藻赤潮期間, 毛蚶有可能通過攝食產毒藻而蓄積高含量的麻痹性貝毒, 對消費者健康乃至生命安全造成威脅。因此, 對毛蚶體內麻痹性貝毒轉化過程與規律的探究對于深入了解麻痹性貝毒風險、保護海產品消費者健康具有重要意義。目前, 針對貝類體內麻痹性貝毒的累積、轉化和排出過程已開展了大量研究, 揭示了貽貝、扇貝、牡蠣等諸多貝類中麻痹性貝毒的轉化過程和規律(Choi, 2003; Kwong, 2006; Wiese, 2010)。本研究選擇了太平洋亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻作為產毒藻種, 前者主要產生-磺酰氨甲?；惗舅睾桶被姿狨ヮ惗舅? 后者主要產生-磺酰氨甲酰基類毒素和脂溶性的GC毒素, 二者毒素組成存在一定的互補性, 通過對比分析毛蚶暴露于上述兩種產毒藻后體內麻痹性貝毒含量和組成的變化, 對毛蚶轉化麻痹性貝毒的過程進行了研究和分析。

3.1 R1位點羥基還原反應

毛蚶暴露于太平洋亞歷山大藻后, 體內出現了較多的GTX2&3, 這在投喂的太平洋亞歷山大藻中沒有檢測到; 而太平洋亞歷山大藻產生的GTX1&4, 在毛蚶中卻未被檢出。說明在毛蚶體內發生了麻痹性貝毒的轉化。毛蚶體內出現的GTX2&3可能是由GTX1&4通過R1位點的羥基還原反應產生, 這一反應目前也已在扇貝、貽貝等多種貝類中被確認(Shimizu, 1981; Andres, 2019)。本研究發現, 暴露于太平洋亞歷山大藻后, 毛蚶體內未檢測到GTX1&4, 這可能由于貝類對不同毒素的選擇性排出(DeGrasse, 2014; Tobke, 2021)造成的。然而, 實驗結果表明, 暴露于太平洋亞歷山大藻的毛蚶體內毒素總量與投喂的亞歷山大藻中毒素總量基本相當, 表明實驗期間毛蚶對毒素的選擇性排出過程可以忽略。由此推測, 毛蚶中的GTX1&4主要通過羥基還原過程生成了GTX2&3。在向毛蚶投喂太平洋亞歷山大藻的實驗中, 所有取樣階段均未在毛蚶體內檢測到GTX1&4, 表明毛蚶中R1位點羥基的還原反應具有較高的反應速率。在部分貝類中, 當存在谷胱甘肽等還原劑時, R1位點羥基還原反應還可能伴有R2和R3位點磺酸基團的還原(Bricelj, 1998362; 朱明遠等, 2003)。本研究發現, 毛蚶在暴露于太平洋亞歷山大藻時, GTX2&3產生后并未出現STX, 推測毛蚶體內麻痹性貝毒的還原反應具有一定的位點特異性。

對比分析實驗結果推測, R1位點的羥基還原反應與毛蚶攝入鏈狀裸甲藻后STX的產生也有一定關系。STX的產生源自GTX5 R4位點的磺酸基水解過程。本實驗中使用的太平洋亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻均能產生少量GTX5, 但毛蚶在攝入鏈狀裸甲藻后體內出現STX, 而攝入太平洋亞歷山大藻后卻未檢測到STX, 推測鏈狀裸甲藻中高含量的GTX6在毛蚶體內發生R1位點羥基的還原反應, 持續轉化生成GTX5并進一步通過水解反應產生了可檢測到的STX。而太平洋亞歷山大藻中GTX5含量較少, 即便發生了轉化, STX含量也不足以被檢測。

3.2 R4位點磺酸基和羥基苯甲酸基團的水解反應

根據以往研究, 毛蚶體內出現的GTX2&3還可能源自C1&2 R4位磺酸基的水解過程, 這一過程也在多種貝類中被證實。Asakawa等(1995)研究認為, 紫貽貝和牡蠣中可能存在C1&2水解轉化為GTX2&3的過程, Choi等(2003)933發現在翡翠貽貝消化腺中也存在類似過程, 邴曉菲等(2017)也證實了櫛孔扇貝中同樣存在此類毒素轉化過程。將毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻后體內毒素成分的變化情況進行對比發現, 在攝入同樣產C1&2但不產生GTX1&4的鏈狀裸甲藻后, 毛蚶體內也出現了GTX2&3, 而鏈狀裸甲藻中的其他麻痹性貝毒都無法直接轉化為GTX2&3, 這說明毛蚶中的GTX2&3可以來自C1&2的水解。

在暴露于鏈狀裸甲藻的毛蚶體內檢測到藻中含量極低的脫氨甲酰基類毒素dcGTX2&3與dcSTX, 表明鏈狀裸甲藻產生的某些毒素在毛蚶體內發生了轉化, 生成了脫氨甲酰基類毒素。毛蚶在攝入太平洋亞歷山大藻后, 體內并未檢測到任何脫氨甲?；惗舅? 側面反映了太平洋亞歷山大藻產生中的C1&2, GTX1&4等毒素成分不會在毛蚶體內轉化生成脫氨甲?；惗舅?。毛蚶攝入鏈狀裸甲藻后體內出現的脫氨甲?；惗舅刂豢赡軄碜枣湢盥慵自逯械莫毺氐腉C毒素。Vale(2008)1已通過研究指出, GC毒素可以通過R4位羥基苯甲酸基團的水解反應, 生成相應的脫氨甲?；惗舅?。因此, 毛蚶體內的脫氨甲?；惗舅刈钣锌赡軄碜訥C毒素的水解反應, 如GC1&2轉化生成dcGTX2&3, GC3轉化生成dcSTX。毛蚶攝入太平洋亞歷山大藻后未產生脫氨甲酰基類毒素, 說明此類水解反應具有一定的特異性, 僅對R4位點為羥基苯甲酸基團的GC毒素有作用。本研究中未在毛蚶體內檢測到GC4&5和GC6的水解產物dcGTX1&4和dcNEO, 其中, dcGTX1&4并未被納入本研究的檢測范圍, 無法證明GC4&5的水解反應是否發生; 而本研究對dcNEO的檢測限相對較高, 對dcNEO的檢測具有一定局限性。因此, 目前仍無法確證毛蚶體內是否存在GC4&5和GC6的水解轉化過程。本研究中使用的鏈狀裸甲藻GC5占比很高, 而毛蚶體內GC5占比明顯下降, 說明GC5很可能在毛蚶體內發生了轉化。毛蚶中GC2占比的明顯增加, 說明GC5極有可能通過R1位點羥基還原反應生成了相應的GC2。這些轉化過程仍有待于更深入的研究進行確證。

3.3 毛蚶體內毒素轉化過程與其他貝類的差異

本研究發現, 毛蚶體內主要存在三類麻痹性貝毒的轉化反應過程, 分別是R1位點羥基還原反應、R4位點磺酸基團的水解反應和R4位點羥基苯甲酸基團的水解反應(圖6)。但是, 也有以往報道過的麻痹性貝毒轉化過程在此次實驗并未發現。首先是麻痹性貝毒空間異構體的差向異構化反應。在產毒藻種中, 通常型毒素占比更高, 而在貝類中麻痹性貝毒會通過差向異構化生成更為穩定的型毒素(Asakawa, 2006), 最后達到:=3:1的比例(Bricelj, 1998359; 柳陽, 201792)。本次實驗中沒有觀察到明顯的差向異構化反應, 可能與實驗時間較短、差向異構化反應速率較慢有關。但研究中也發現, 鏈狀裸甲藻中型的GC1的含量很低, 占比遠低于其型同分異構體GC2; 而在毛蚶體內, 由GC1轉化而來的dcGTX2占比卻高于由GC2轉化而來的dcGTX3。這說明在GC1&2發生羥基苯甲酸基團水解反應的同時, 也出現了差向異構化反應。但目前無法確定毒素的差向異構化反應與水解反應時間的先后, 仍有待于進一步研究。

圖6 毛蚶體內可能發生的各類毒素轉化過程

注: 虛線箭頭表示該反應為理論上可能發生的過程

此外, 本研究也未在毛蚶體內發現-磺酰氨甲酰基類毒素或氨基甲酸酯類毒素水解生成脫氨甲酰基類毒素的酶促轉化過程(Raposo, 2020)4。Samsur等(2006)在錦蛤()中發現C1&2可以被轉化生成dcGTX2&3。在象拔蚌()中也發現C1&2轉化為GTX5后水解生成dcSTX的轉化反應(Medina-Elizalde, 2018)。毛蚶在攝入產C1&2的太平洋亞歷山大藻后, 體內未檢測到脫氨甲酰基類毒素, 說明毛蚶中可能缺乏磺氨甲酰基水解酶, 難以促成-磺酰氨甲酰基的水解反應。同樣, 在多種貝類中發現的氨基甲酸酯類毒素轉化生成相應的脫氨甲?；惗舅氐霓D化過程, 也是一種典型的酶促水解反應。在中國飛蛤()中分離出了能夠轉化氨基甲酸酯類毒素為脫氨甲酰基類毒素的氨甲酰基水解酶(Lin, 2004)。在本研究中, 毛蚶攝入太平洋亞歷山大藻后體內并未檢測到脫氨甲?；惗舅? 說明了毛蚶中也可能缺乏氨甲?；饷? 無法催化進行此類轉化反應。綜上, 毛蚶中可能缺少催化-磺酰氨甲?；虬奔柞；獾拿割? 但是存在能夠催化羥基苯甲酸基團水解反應的酶。

3.4 毒素轉化過程對毛蚶毒性的影響

毛蚶體內發生的麻痹性貝毒轉化過程可能會顯著影響毛蚶的毒性。本研究發現毛蚶體內麻痹性貝毒轉化過程主要包括R1位點羥基還原反應、R4位點磺酸基團水解反應和R4位點羥基苯甲酸基團水解反應。R1位點羥基還原反應對毛蚶的毒性可能有重要影響。一般來說, R1位點為羥基的麻痹性貝毒組分毒性高于對應的R1位點為氫的麻痹性貝毒組分(Leal, 2022)21, 因此, 毛蚶體內的R1位點羥基還原反應會導致毒性降低。同樣, R4位點的水解反應也會顯著改變毛蚶體內毒素組成, 從而影響其毒性。在麻痹性貝毒中,-磺酰氨甲?；惗舅嘏c鈉離子通道的結合能力最差, 毒性也相對最低; 而氨基甲酸酯類毒素則是毒性最高的毒素, 脫氨甲酰基類毒素的毒性位于兩者之間。-磺酰氨甲?；惗舅赝ㄟ^水解反應生成相應的氨基甲酸酯類毒素, 會導致貝類毒性的顯著上升。目前, 對于毛蚶中GC毒素的水解反應, 仍難以判斷其對毛蚶毒性的影響。此外, M毒素是貝類攝食麻痹性貝毒產毒藻后的重要代謝物, 毒性水平較低, 有助于其快速脫毒(Vale, 2010; Ding, 2017)。本研究聚焦于各類型麻痹性貝毒的轉化過程, 并未分析該類代謝物, 需要在后續研究中予以關注?？傮w而言, 毛蚶體內的麻痹性貝毒轉化過程較為復雜, 對毒性的影響需要結合產毒藻的毒素種類進行具體分析。為防范毛蚶帶來的麻痹性貝毒中毒風險, 仍需加強對毛蚶體內麻痹性貝毒的監測, 避免造成中毒事件。

4 結論

本研究通過選擇典型產毒藻種開展模擬實驗, 揭示了毛蚶體內麻痹性貝毒的三類主要轉化過程, 包括R1位點羥基的還原反應、R4位點磺酸基團的水解反應, 以及R4位點羥基苯甲酸基團的水解反應, 推測毛蚶體內缺少可催化-磺酰氨甲酰基類毒素和氨基甲酸酯類毒素水解過程的酶。這些發現說明毛蚶對麻痹性貝毒的轉化反應較為多樣化, 且有一定的獨特性, 可能導致毛蚶體內毒素組成與產毒藻種或其他貝類存在差異, 需要加強對毛蚶體內麻痹性貝毒的監測和研究。

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BIOTRANSFORMATION OF PARALYTIC SHELLFISH TOXINS IN BLOOD CLAM

LIN Zhuo-Ru1, 3, GENG Hui-Xia1, TANG Wen-Jiao1, 5, YU Ren-Cheng1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 5. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The accumulation of paralytic shellfish toxins in marine bivalves pose severe threats to human health.may contain high concentrations of paralytic shellfish toxins, yet toxin biotransformation in.and its effect on the toxicity of the bivalve remain largely unknown. Therefore, biotransformation of paralytic shellfish toxins in.were investigated by feeding.with two toxin-producing dinoflagellates,and. Reduction of hydroxyl at R1, hydrolysis of sulfocarbamoyl group at R4 in-sulfocarbamoyl toxins, and hydrolysis of hydroxybenzoate group at R4 intoxins are the main biotransformation processes in.. The complex biotransformation of paralytic shellfish toxins in.contributes to the uncertainty of toxicity. To reduce risks associated with paralytic shellfish poisoning, further investigations on accumulation, transformation, and elimination of paralytic shellfish toxins in.should be carried out, and more efforts are needed to monitor toxins in..

paralytic shellfish toxins;;;;toxins; toxin biotransformation

X174

10.11693/hyhz20220100024

*國家重點研發計劃, 2017YFC1600701號; 科技基礎資源調查專項, 2018FY100202號; 國家自然科學基金委員會聯合基金項目, U20A20104號。林卓如, 博士研究生, E-mail: linzhuoru@qdio.ac.cn

于仁成, 博士生導師, 研究員, E-mail: rcyu@qdio.ac.cn

2022-01-26,

2022-03-21