大黃魚STAT6分子特征及其在溶藻弧菌感染后表達模式研究*

袁曉琴 陳 友 榮 毅 孟鈺帆 任超群 母尹楠① 陳新華, 2①

大黃魚分子特征及其在溶藻弧菌感染后表達模式研究*

袁曉琴1陳 友1榮 毅1孟鈺帆1任超群1母尹楠1①陳新華1, 2①

(1. 福建農林大學生命科學學院 福建農林大學海洋學院 福建省海洋生物技術重點實驗室 福建福州 350002; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 山東青島 266237)

信號轉導和轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)是兼具信號轉導和轉錄活化功能的一類蛋白, 在細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。目前, 關于魚類基因的分子特征及其在病原感染過程中表達模式研究仍相對較少。克隆了大黃魚基因()的開放閱讀框序列, 其全長2 211個核苷酸, 編碼1個含736個氨基酸的蛋白質。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),STAT6蛋白具有5個保守的功能結構域, 包括氨基端結構域、卷曲螺旋結構域、DNA結合結構域、SH2結構域和轉錄激活結構域。系統(tǒng)進化分析顯示,STAT6和其他硬骨魚類STAT6聚為一支, 與棘頭梅童魚() STAT6的親緣關系最近, 與兩棲類、鳥類和哺乳類STAT6的親緣關系相對較遠。實時熒光定量PCR結果顯示,在所檢測的大黃魚各組織或器官中均有表達, 尤其在血液、鰓、脾臟等免疫相關組織中表達量相對較高; 蛋白免疫印跡實驗顯示其蛋白也在鰓和脾臟中高表達。溶藻弧菌()感染后, 大黃魚頭腎和脾臟組織中的mRNA水平都顯著上調, 達到峰值時分別上升了3.82倍和6.54倍; 同時大黃魚頭腎組織中STAT6蛋白及其磷酸化蛋白水平也明顯上調, 頭腎白細胞細胞核內STAT6的蛋白量也顯著增加。此外, 溶藻弧菌感染后,STAT6下游效應基因和表達水平顯著升高。這些研究結果表明STAT6可能在大黃魚抗病原感染的免疫應答中發(fā)揮重要作用, 該結果對于深入認識STAT蛋白在魚類免疫防御中的調控機制具有重要意義。

大黃魚; STAT6; 多克隆抗體; 表達模式; 免疫應答

信號轉導和轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)是一類既有信號轉導又有轉錄活化功能的蛋白, 由特定的細胞因子、生長因子或激素激活, 在細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用(Sung, 2010)。STAT家族由7個成員組成: STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6, 它們都具有相對保守的功能結構域, 包括氨基端結構域(N-terminal interaction domain)、卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain)、DNA結合域(DNA binding domain)、SH2結構域(Src homology 2)、磷酸化位點(phosphorylation site)和羧基端轉錄激活結構域(transcriptional activation domain) (宋舟等, 2012)。STAT6是輔助型T細胞2 (T helper 2 cell, Th2)分化過程中的特異性轉錄因子, 主要由白細胞介素4 (Interleukin-4, IL-4)和IL-13激活, 可促進Th2細胞增殖并分泌IL-4、IL-10、IL-13等細胞因子(Wills-Karp, 2008)。此外, 活化的STAT6還能夠誘導精氨酸酶()、II類組織相容性復合物()、等基因表達(Kelly-Welch, 2005; Satoh, 2010)。

近年來, 已經在多種魚類中鑒定得到了基因, 如斑點綠河豚() (Sung, 2010)、斑馬魚() (Mitra, 2010)、花鱸() (于小娜等, 2016)、鱖() (Guo, 2009)等。花鱸具有保守的結構特征, 在脾、頭腎、鰓、大腦和腸組織中表達量相對較高, 哈維氏弧菌()刺激后, 其在脾、頭腎、腸和鰓中的轉錄水平都顯著上調(于小娜等, 2016); 鱖mRNA在脾臟中表達量最高, poly I: C刺激后48 h, 鱖仔魚細胞系(MFF-1)中的表達水平也顯著升高(Guo, 2009); 這些結果表明STAT6可能在魚類的抗病原感染過程中發(fā)揮著重要作用。斑馬魚STAT6已被證實是IL-4信號通路的重要信號分子, IL-4誘導后STAT6磷酸化水平及細胞核內積累水平都顯著升高, 說明IL-4通過激活STAT6促進B細胞增殖和特異性IgM的產生(Zhu, 2012; Bhattarai, 2016)。

大黃魚()是我國重要的海水經濟魚類, 也是我國海水養(yǎng)殖魚類中產量最高的魚類(霍振華等, 2018)。但是隨著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 由細菌、病毒和寄生蟲引發(fā)的疾病頻繁暴發(fā), 給大黃魚產業(yè)造成了巨大的經濟損失(Chen, 2003; Mu, 2014; 陳洪清, 2019; Li, 2020)。因此, 解析大黃魚應對病原感染的免疫應答機制將有助于制定有效的病害防治措施。本研究克隆并鑒定了大黃魚基因(), 利用熒光定量PCR、蛋白免疫印跡、免疫熒光等技術, 檢測了其在健康大黃魚組織或器官以及免疫細胞中的表達水平, 分析了溶藻弧菌()感染后大黃魚頭腎和脾臟中STAT6的表達變化, 這些結果表明STAT6可能在大黃魚抗細菌感染的免疫應答中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

將購自寧德市富發(fā)水產有限公司的大黃魚[體長: (15.0±1.3) cm; 體質量: (60.0±15.2) g]適應性養(yǎng)殖7 d, 水溫為25 °C左右, 溶解氧為7.6 mg/L左右。將大黃魚分為正常組、對照組和實驗組, 每組40尾。實驗組大黃魚腹腔注射100 μL (1.0×108CFU)的溶藻弧菌, 對照組大黃魚注射等體積無菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS; pH=7.4), 分別于注射后 6、12、24和48 h 采集大黃魚的頭腎和脾臟組織樣品, 每個時間點采集9尾。同時采集正常組大黃魚的心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腸、血液、鰓、腦、皮膚和肌肉組織, 放入液氮中速凍, 于–80 °C超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

使用Eastep? Super Total RNA Extraction Kit (Promega, 美國)提取大黃魚組織的總RNA, 再使用Eastep? RT Master Mix Kit (Promega, 美國)將提取的總RNA反轉錄成第一鏈cDNA, 具體操作步驟參照試劑盒的說明書。

1.3 LcSTAT6基因克隆與序列分析

從大黃魚基因組數(shù)據庫中查找到6基因的編碼序列(GenBank登錄號: XM_010748295.3), 根據預測序列設計特異引物(表1), 以大黃魚脾臟cDNA為模板, PCR擴增其開放閱讀框(open reading frame, ORF)序列, 并測序驗證。生物信息學分析: 使用DNAMAN8進行多序列比對分析; 使用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)在線軟件預測STAT6蛋白質的功能結構域; 利用MEGA7.0軟件, 采用鄰接法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)進化樹, 其他物種的STAT6序列均來自GenBank數(shù)據庫(序列信息詳見表2)。

1.4 抗LcSTAT6多克隆抗體制備

利用在線軟件BepiPred 1.0 Server (http://www. cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)預測STAT6的抗原表位選取預測分值最高的區(qū)域QQPFSPSESLPPEGC (第691～704位氨基酸), 利用Fmoc固相合成法合成多肽, 合成的多肽再偶聯(lián)血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)制備成抗原, 濃度為1 mg/mL。按1︰1比例將抗原與弗氏完全佐劑混合, 免疫2只新西蘭兔, 初次免疫使用抗原劑量為500 μg/只。2周后, 按1︰1比例將抗原與弗氏不完全佐劑混合, 加強免疫3次, 間隔時間為一周, 加強免疫使用抗原劑量為250 μg/只。最后一次免疫后第7天, 收集兔血清, 使用Protein A親和層析柱(碧云天, 中國)純化血清中多克隆抗體, 多克隆抗體效價采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測。ELISA方法如下: 以制備的多肽為包被抗原(濃度為20 μg/mL), 96孔板每孔加抗原100 μL, 4 °C包被過夜, 再使用2%的脫脂奶粉進行封閉; 以陰性兔血清為陰性對照, 將待測多克隆抗體梯度稀釋, 每孔加100 μL, 37 °C孵育1 h, 經PBST緩沖液洗滌后, 加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔IgG (H+L)多克隆抗體(1:3 000)孵育1 h; 洗滌后加入顯色液顯色(索萊寶, 中國), 最后使用酶標儀測定OD450nm處的吸光值, 當測得的吸光值是陰性對照吸光值2倍時判定為陽性(多克隆抗體效價即是最大稀釋度)。

表1 引物序列信息

Tab.1 Primer information

表2 大黃魚STAT6與其他物種STAT6氨基酸序列的一致性分析

Tab.2 The identity between LcSTAT6 and other known STAT6 proteins

1.5 LcSTAT6在大黃魚組織中的表達分析

利用針對基因的特異性引物-RT-F和-RT-R (表1), 并以大黃魚基因作為內參基因, 進行熒光定量PCR實驗, 檢測在正常狀態(tài)下和細菌感染后大黃魚組織或器官中的表達水平。熒光定量PCR反應體系如下: 2×SYBR Green I (諾唯贊, 中國) 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL, cDNA模板0.2 μL, 無菌水9.6 μL。反應條件: 95 °C預變性2 min, 95 °C變性15 s, 57 °C退火20 s, 72 °C延伸20 s, 共40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt方法計算的相對表達水平(Livak, 2001), 并使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.6 蛋白質免疫印跡(Western Blot)

在組織勻漿器中加入1 mL組織裂解液和約100 mg大黃魚組織, 利用組織勻漿器裂解組織, 勻漿液經4 °C, 15 000離心10 min, 收集上清。上清內蛋白經12% SDS-PAGE電泳后, 轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore, 德國)上, 在含有5% ()脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉1 h, 然后使用本實驗制備的抗STAT6多克隆抗體(1︰1 000)孵育1 h, 經TBST緩沖液洗滌后, 再用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔IgG(H+L)多克隆抗體(Abmart,中國; 1:5 000)孵育1 h, 最后使用化學發(fā)光檢測試劑(新賽美, 中國)進行顯色。β-微管蛋白(β-tubulin)作為蛋白內參, 所用抗體為鼠抗人β-tubulin單克隆抗體(Abmart, 中國; 1︰3 000)。

1.7 間接免疫熒光實驗(Indirect immunofluorescence assay, IFA)

取健康大黃魚的頭腎組織, 置于70 μm細胞濾網(BD, 美國)上輕輕研磨, 用含1%肝素鈉的PBS沖洗制成細胞懸液, 再將細胞懸液添加到34%/51% Percoll溶液(Thermo, 美國)表面, 4 °C, 650離心30 min。離心后, 吸取中間細胞層, 使用L-15培養(yǎng)基(HyClone, 美國)洗滌3次, 再使用5 mL L-15培養(yǎng)基重懸細胞, 按照每孔2.0×106個細胞接種到6孔板, 即獲得大黃魚頭腎原代白細胞(Mu, 2018)。向大黃魚頭腎原代白細胞中加入500 μL預冷的4%組織細胞固定液(索萊寶, 中國), 室溫固定30 min, 再加入2 μg鼠抗人β-tubulin抗體和制備的抗STAT6多克隆抗體, 清洗之后加入Alexa Fluor 488標記羊抗鼠IgG (H+L) (Abmart, 中國)和Alexa Fluor 647羊抗兔IgG (H+L) (1:200), 最后使用激光共聚焦顯微鏡(徠卡DMI8, 德國)觀察結果。

2 結果

2.1 大黃魚STAT6分子特征與進化分析

基因ORF全長2 211個核苷酸, 編碼1個含有736個氨基酸(amino acid, aa)的蛋白質(圖1), 該蛋白的分子量為83.5 kDa, 等電點為7.33。氨基酸序列分析結果顯示:STAT6與哺乳動物STAT6類似, 具有5個保守的功能結構域: 氨基端結構域(1～106 aa)、卷曲螺旋結構域(126～288 aa)、DNA結合結構域(290～535 aa)、SH2結構域(544～631 aa)和轉錄激活結構域(632～736 aa) (圖2)。序列一致性分析發(fā)現(xiàn),STAT6與棘頭梅童魚() STAT6的序列一致性最高, 達到89.76%, 其次為豹紋鰓棘鱸()、烏鱧()、奧利亞羅非魚()以及虹鱒(), 序列一致性分別為85.21%、78.09%、70.88%和64.83% (表2)。系統(tǒng)進化分析顯示,STAT6 與其他魚類的STAT6聚為一支, 而哺乳類、兩棲類和鳥類的STAT6聚為一支;STAT6與棘頭梅童魚STAT6的親緣關系最近(圖3)。

圖1 大黃魚STAT6核苷酸與氨基酸序列

注: 單下劃線指示氨基端結構域, 陰影指示卷曲螺旋結構域, 方框指示DNA結合結構域, 虛線指示SH2結構域, 雙下劃線指示轉錄激活結構域, 星號代表終止密碼子

2.2 LcSTAT6在正常大黃魚組織或器官中的表達譜

采用熒光定量PCR技術檢測了正常大黃魚血液、鰓、心臟、脾臟、腦、頭腎、肌肉、肝臟、腸和皮膚等器官或組織中的表達水平。結果顯示:mRNA在所有檢測的器官或組織中均有表達, 其中在血液中的表達量最高, 其次為鰓、心臟和脾臟, 皮膚中的表達量最低(圖4a)。為了研究STAT6蛋白在不同組織或器官中表達水平, 我們制備了兔抗STAT6的多克隆抗體, 獲得抗體2.7 mg, 濃度為1.6 mg/mL, 效價約為 1×107(圖4b)。使用該抗體進行蛋白免疫印跡實驗, 結果顯示:STAT6蛋白在大黃魚頭腎、脾臟、皮膚和鰓中均有表達, 在鰓組織中蛋白水平顯著高于頭腎、脾臟和皮膚(圖4c, 4d)。

圖2 大黃魚STAT6與其他物種同源蛋白的氨基酸序列比對

注: 序列上方的直線分別指示氨基端結構域、卷曲螺旋結構域、DNA結合結構域、SH2結構域和轉錄激活結構域

圖3 鄰接法構建的STAT6系統(tǒng)進化樹

注: 基于大黃魚和其他脊椎動物STAT6氨基酸序列構建了系統(tǒng)進化樹, 使用的軟件是MEGA 7.0

注: a. 熒光定量PCR檢測在大黃魚組織中的表達譜; b. 間接ELISA分析抗STAT6多克隆抗體效價; c. 蛋白免疫印跡檢測STAT6蛋白在大黃魚頭腎、脾臟、皮膚和鰓組織中表達; d. 蛋白免疫印跡結果的灰度值分析

2.3 溶藻弧菌感染后LcSTAT6轉錄與蛋白水平變化

為了了解STAT6是否參與大黃魚免疫應答, 使用溶藻弧菌感染大黃魚, 檢測大黃魚頭腎和脾臟中的轉錄和蛋白表達水平變化。結果顯示: 溶藻弧菌感染后, 大黃魚頭腎和脾臟中的轉錄水平均從6 h開始上調, 在24 h達到最高值, 分別是對照組的3.82倍和6.54倍, 而48 h時其表達量回落至對照組的1.49倍和2.01倍(圖5a)。通過蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn), 溶藻弧菌感染后48 h, 大黃魚頭腎組織中磷酸化的STAT6蛋白明顯增加, 是對照組的1.43倍(圖5b, 5c), 同時大黃魚頭腎白細胞細胞核內紅色熒光明顯多于對照組, 說明溶藻弧菌感染后細胞核內STAT6蛋白量也顯著增加(圖5d)。

2.4 溶藻弧菌感染后LcSTAT6下游基因表達變化

如圖6所示, 溶藻弧菌感染后, 大黃魚脾臟和頭腎中STAT6下游基因的轉錄水平在12 h均有所下調, 24 h開始升高, 分別于24 h和48 h達到最高值, 是對照組的1.39倍和1.63倍(圖6a)。相對于, 大黃魚脾臟和頭腎中的轉錄水平變化更為明顯, 表達量從12 h就開始增加, 分別于24 h和48 h達到峰值, 是對照組的6.07倍和2.38倍(圖6b)。

3 討論

JAK-STAT信號通路參與多種細胞因子和生長因子信號轉導的途徑, 在細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等過程都發(fā)揮重要作用(吳平, 2014)。STAT蛋白是細胞質轉錄因子, 與激活的受體復合物結合后被激活, 形成二聚體后轉移到細胞核, 在核內激活靶基因的轉錄(Rawlings, 2004)。在哺乳動物中, 有7種具有不同功能的STAT蛋白, 其中STAT6不僅參與調節(jié)免疫系統(tǒng), 而且與細胞增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生密切相關(宋舟等, 2012)。目前, 已經在多種魚類中鑒定了基因, 發(fā)現(xiàn)其具有相對保守的結構特征(Guo, 2009; Sung, 2010; 吳平, 2014;于小娜等, 2016), 但是關于魚類STAT6在病原感染過程中表達模式的報道仍相對較少。

圖5 溶藻弧菌感染后大黃魚LcSTAT6轉錄與蛋白表達水平變化

注: a. 熒光定量PCR檢測溶藻弧菌感染后大黃魚頭腎和脾臟中基因的轉錄水平變化; b. 蛋白免疫印跡檢測溶藻弧菌感染后大黃魚頭腎白細胞中STAT6的蛋白水平變化; c. 蛋白免疫印跡結果的灰度值分析; d. 使用激光共聚焦顯微鏡觀察溶藻弧菌感染后大黃魚頭腎白細胞中STAT6的蛋白分布情況

圖6 溶藻弧菌感染后LcSTAT6下游基因表達變化

注: 熒光定量PCR檢測溶藻弧菌感染后STAT6下游基因mRNA表達情況。a.; b.。*代表顯著性差異(<0.05), **代表差異極顯著(<0.01)

本研究從大黃魚脾臟中克隆得到了基因的ORF序列, 包含2 211個核苷酸, 編碼1個含有736個氨基酸的蛋白質。經序列比對分析發(fā)現(xiàn),STAT6與哺乳類STAT6相似, 具有5個保守的功能結構域, 包括氨基端結構域、卷曲螺旋結構域、DNA結合結構域、SH2結構域和轉錄激活結構域。這些結構域的作用在哺乳類中已經研究得較為清楚, 其中氨基端結構域有助于DNA結合域與DNA的結合, 卷曲螺旋結構域對整個蛋白的結構維持起剛性骨架作用(吳平, 2014); DNA結合結構域主要作用是在蛋白發(fā)生磷酸化入核后與特異的DNA序列結合, 促進相應基因轉錄(宋舟等, 2012); SH2結構域是STAT蛋白序列上最保守和功能上最重要的區(qū)域, 對其二聚化起關鍵作用(宋倫等, 2000); 羧基端轉錄激活結構域主要介導與轉錄起始復合物中的其他成分相互作用(張穎芬, 2009)。系統(tǒng)進化分析表明,STAT6與其他魚類STAT6聚為1支, 獨立于哺乳類、兩棲類和鳥類的STAT6形成的分支, 表明魚類STAT6和其他物種STAT6存在共同的祖先, 預示著魚類STAT6可能具有與哺乳動物STAT6相似的功能, 但在進化上又有一定的差異, 可能演化出魚類特有的功能特性。

組織表達分析表明,在所檢測的組織中均有表達, 但在血液、鰓和心臟組織中表達量相對較高, 在肝臟、腸和皮膚中表達量相隨較少。斑點綠河豚的組織分布模式與類似, 也是在心臟中表達量較高, 但在腸道、肝臟和睪丸中表達量也相對較高, 這與有所不同(Sung, 2010)。鱖和黃顙魚()mRNA在脾臟中表達量最高, 其次為心臟、鰓和腎臟(Guo, 2009; Wu, 2016)。花鱸mRNA在脾、頭腎和腸組織中高表達, 但在心臟、眼和肌肉中表達量相對較低(于小娜等, 2016)。雖然不同魚類的組織表達模式略有差異, 但都在免疫器官如頭腎、脾臟和血液中表達量相對較高, 可能由于這些免疫器官中含有大量免疫細胞, 如巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞等(母尹楠等, 2020),在免疫器官中高表達可能是在某些免疫細胞中表達量較高所致。

為了探明STAT6在大黃魚免疫應答中的作用, 我們檢測了溶藻弧菌感染后STAT6在兩個重要免疫器官頭腎和脾臟中的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌感染后, 大黃魚脾臟和頭腎中的轉錄水平都顯著上調, 頭腎組織中磷酸化的STAT6蛋白明顯增加, 頭腎白細胞細胞核內STAT6蛋白的累積量也顯著增加, 表明溶藻弧菌感染激活了STAT6信號轉導通路。相似的結果在其他魚類中也有報道, 當花鱸腹腔注射哈維氏弧菌后,在脾和頭腎組織中表達水平也顯著上調(于小娜等, 2016); 除此之外, 研究還發(fā)現(xiàn)鱖表達也能被poly I:C誘導(Guo, 2009); 這些結果表明STAT6在魚類抗病原感染過程中起著重要作用。此外, 我們還發(fā)現(xiàn), 溶藻弧菌感染后STAT6下游基因(和)表達水平顯著升高, 說明入核后的STAT6可能與其特定的DNA結合位點結合, 調控效應基因轉錄。

4 結論

綜上所述, 本研究鑒定了大黃魚的分子特征, 通過熒光定量PCR、蛋白免疫印跡、免疫熒光等技術發(fā)現(xiàn)大黃魚在所有檢測的組織或器官中呈組成型表達, 溶藻弧菌感染后, 其轉錄水平、蛋白水平、磷酸化水平以及細胞核內累積水平都顯著升高, 同時其下游效應基因表達水平也顯著上調, 這些研究結果表明STAT6可能在大黃魚抗病原感染的免疫應答中發(fā)揮重要作用, 為今后闡明STAT6在魚類免疫應答中的調控機制提供基礎數(shù)據。

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MOLECULAR CHARACTERIZATION AND EXPRESSION ANALYSIS OFIN LARGE YELLOW CROAKER () AFTERINFECTION

YUAN Xiao-Qin1, CHEN You1, RONG Yi1, MENG Yu-Fan1, REN Chao-Qun1, MU Yin-Nan1, CHEN Xin-Hua1, 2

(1. Key Laboratory of Marine Biotechnology of Fujian Province, College of Marine Sciences, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

Signal transducers and activators of transcription (STAT) is a type of protein with both signal transduction and transcription activation function, and plays an important role in cell proliferation, differentiation, migration and apoptosis. In recent years,has been identified in several fish species. However, very few information is available about its expression pattern during pathogen infection. We cloned the full length of open reading frame (ORF) ofgene () in large yellow croaker (), which contained 2 211 nucleotides encoding a peptide of 736 amino acids. The deducedSTAT6 protein contained five typical functional domains: N-terminal interaction domain, coiled-coil domain, DNA binding domain, SH2 domain, and transcriptional activation domain. Phylogenetic analysis showed thatSTAT6 formed a separate clade with sequences from other fish species and was far from the clades of avian, amphibian, and mammalian STAT6 proteins. TheSTAT6 was most closely related toSTAT6.mRNA was constitutively expressed in all examined tissues of large yellow croaker, especially higher in blood, gill, and spleen. The Western blot showed thatSTAT6 was highly expressed in gills and spleen. After being infected with, the mRNA expression level ofwas elevated in head kidney and spleen, and its phosphorylated protein level in head kidney of large yellow croaker were significantly up-regulated. Indirect immunofluorescence assay showed thatSTAT6 was activated and transferred into the nucleus of leukocytes from head kidney afterinfection. Moreover, the transcriptional levels of the downstream genes (and) ofSTAT6 were also up-regulated in head kidney and spleen tissues afterinfection. These results indicate thatSTAT6 may play important roles in the immune response to pathogen infection of large yellow croaker, and provide valuable information for understanding the regulation mechanism of STAT6 in fish immune defense.

large yellow croaker (); STAT6; polyclonal antibody; expression pattern; immune response

Q789; S965

10.11693/hyhz20211200326

*國家自然科學基金面上項目, 32073007號; 福建省自然科學基金杰青項目, 2021J06016號; 財政部和農業(yè)農村部: 國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系資助, CARS-47號; 福建農林大學優(yōu)博項目, 324-1122YB063號。袁曉琴, 博士研究生, E-mail: 1825639283@qq.com

陳新華, 博士生導師, 教授, E-mail: chenxinhua@tio.org.cn; 母尹楠, 博士, 碩士生導師, E-mail: muyinnan@ 163. com

2021-12-15,

2022-01-26