投喂頻率對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)PI3K信號通路及糖代謝相關酶基因表達的影響*

趙楠楠 崔彥婷 王忠凱 王 聰 張志豪 鄧之通 趙瑞陽 孫金鳳 王仁杰 李玉全

投喂頻率對凡納濱對蝦()PI3K信號通路及糖代謝相關酶基因表達的影響*

趙楠楠 崔彥婷 王忠凱 王 聰 張志豪 鄧之通 趙瑞陽 孫金鳳 王仁杰 李玉全①

(青島農業大學海洋科學與工程學院 山東青島 266109)

適宜的投喂頻率能提高對蝦的代謝和免疫能力, 加快生長, 實現提質增效的目標。為探討不同投喂頻率對凡納濱對蝦()糖代謝及相關信號通路的影響, 以(7.6±1.0) g的凡納濱對蝦為實驗材料, 設置2、3、4、6次/d, 共4個投喂頻率處理組, 每組設3個平行, 實驗持續14 d, 實驗結束時取樣, 測定PI3K信號通路相關因子、、, 代謝酶基因中、、、、, 葡萄糖轉運蛋白、mRNA表達水平的變化。結果發現: 隨著投喂頻率的增加, PI3K信號通路關鍵基因表達的水平顯著上升(0.05), 其中6次/d投喂組、、和表達水平顯著高于2次/d投喂組(0.05), 4次/d投喂組表達水平顯著高于2次/d投喂組(0.05); 代謝關鍵酶基因、、、、、的表達水平隨投喂頻率的增加而增加, 其中6次/d投喂組糖酵解、、酶基因表達水平顯著高于2次/d投喂組(0.05), 3、4和6次/d投喂組糖異生酶表達水平顯著高于2次/d投喂組(0.05), 葡萄糖轉運蛋白在2、3、6次/d投喂頻率處理組顯著高于4次/d頻率投喂組(0.05)。得出結論認為較高的投喂頻率可以通過激活凡納濱對蝦糖代謝酶基因、糖轉運蛋白及PI3K信號通路的表達來提高糖代謝水平。

凡納濱對蝦; 投喂頻率; 糖代謝酶; 糖轉運蛋白; PI3K信號通路

凡納濱對蝦()又稱南美白對蝦, 由于生長速度快, 抗逆性強, 是國內外主要經濟蝦類之一, 占我國海水對蝦養殖總產量的80.52% (中國漁業統計年鑒, 2021)。投喂策略是養殖管理的重要環節, 其中投喂頻率直接影響養殖對象的攝食量, 從而影響生長和飼料利用率(李笑天等, 2020)。投喂頻率過高或過低都不利于獲得好的養殖效果。研究發現投喂頻率對對蝦生長代謝、免疫和消化有顯著影響: 在凡納濱對蝦研究中發現5次/d頻率投喂時, 生長及飼料利用率最高(陳文霞, 2012); 3次/d、4次/d投喂組仔蝦增重率相近, 且顯著高于7次/d處理組(Pontes, 2008); 12次/d投喂組幼蝦胃中蛋白酶和淀粉酶的活性以及消化腺中脂肪酶的特異性活性顯著高于3次/d投喂組(Xu, 2020); 5次/d、7次/d頻率投喂組的消化酶活力顯著高于2次/d投喂組, 高頻率投喂顯著增強抗氧化能力(楊品賢, 2018)。日本沼蝦()研究中發現3次/d投喂組增重率顯著高于2次/d投喂組(宋大燁等, 2009)。所以, 適宜的投喂頻率能提高對蝦的代謝和免疫能力, 加快生長, 實現“提質增效”(楊品賢等, 2018b)。目前針對投喂頻率對生長影響的分子機制仍不清晰。糖代謝的改變對生長有重大影響, 在哺乳動物的糖代謝過程中, 已發現信號通路和糖代謝關鍵酶之間存在相互調控關系, 比如經典的糖代謝PI3K-Akt信號通路在葡萄糖的吸收和利用中起著關鍵的作用。近年來在對蝦研究中發現PI3K-Akt-mTOR通路可以調控HIF-1, 進而影響糖酵解關鍵酶己糖激酶、磷酸果糖激酶、乳酸脫氫酶的表達(Hernández-Palomares, 2018)。HIF-1還被證實可以調控1,6果糖二磷酸激酶的表達(Cota-Ruiz, 2016), 最終影響葡萄糖和乳酸的含量(So?anez-Organis, 2010)。在蝦類的糖代謝研究中, 信號通路和糖代謝關鍵酶之間相互調控的研究還較匱乏, 僅在對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)、缺氧等脅迫方面略有發現(Cota-Ruiz, 2016; Hernández-Palomares, 2018)。而凡納濱對蝦投喂頻率的研究集中在糖酵解酶, 還未能結合信號通路和關鍵酶基因全面研究投喂頻率對糖代謝水平的影響。因此, 本實驗擬通過研究2次/d、3次/d、4次/d、6次/d 4個不同投喂頻率處理對凡納濱對蝦糖酵解、糖異生酶基因、糖轉運蛋白和PI3K信號通路相關基因表達水平的影響, 明確投喂頻率對糖代謝的影響, 為凡納濱對蝦健康養殖提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗在青島農業大學海洋科學與工程學院實驗室進行, 所用凡納濱對蝦來自山東省海陽市某養殖公司, 玻璃缸(55 cm×47 cm×39 cm)中暫養5 d, 期間水溫(30±0.5) °C、鹽度(30±0.5)、pH=8.0±0.2, 每日投喂人工配合飼料2次, 日換水1/3～1/2, 24 h不間斷充氣(DO≥5 mg/L)。

1.2 實驗設計

實驗設4個投喂頻率, 分別為: 2次/d (9:00、21:00)、3次/d (6:00、14:00、22:00)、4次/d (6:00、11:00、16:00、21:00)和6次/d (6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00), 日投喂量為對蝦濕重的5%, 每個處理35尾對蝦, 設3個平行組, 養殖14 d后取樣(宋大燁等, 2009), 每個處理隨機取6尾對蝦的肝胰腺組織樣品, 存放于–80 °C中備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取和反轉錄 總RNA提取: 參照Trizol試劑(博邁德公司)使用說明書提取凡納濱對蝦肝胰腺組織總RNA; 反轉錄: 參照南京諾唯贊的反轉錄試劑盒[HIScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)], 總體系為20 μL。

1.3.2 熒光定量分析 cDNA模板樣品濃度為5 ng/μL, 南京諾唯贊的熒光定量試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix), 總反應體系為10 μL, 內參基因為β-actin。引物如表1所示。

1.4 數據統計分析

實驗數據采用均值±標準誤(mean±S.E)表示, 利用Prism 7.0軟件的單因素方差(ANOVA)分析檢驗、Tukey多重比較進行統計分析與作圖, 以0.05作為統計學差異顯著水平(*)。

表1 本研究中所用到的引物

Tab.1 Primers used in this study

2 結果

2.1 投喂頻率對凡納濱對蝦糖代謝酶基因表達的影響

凡納濱對蝦糖酵解第一階段反應的關鍵基因己糖激酶(hexokinase,)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,)的表達水平隨著投喂頻率的增加而增加(圖1)。其中, 投喂頻率4次/d和6次/d時基因表達水平顯著高于2次/d (0.05,圖1a); 6次/d處理組基因表達水平顯著高于2次/d和3次/d處理組(0.05), 2次/d～4次/d處理組基因表達水平無顯著差異(>0.05, 圖1b); 6次/d處理組基因表達水平顯著高于2次/d處理(0.05), 2次/d～4次/d處理組間無顯著差異(0.05, 圖1c); 6次/d處理組基因表達水平顯著高于2次/d處理組(0.05, 圖1d)。

糖異生過程中果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6- bisphosphatase,)與磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,)兩個基因的表達水平表現為: 2次/d處理組的基因表達水平顯著低于在其他三個處理組(0.05), 3次/d、4次/d和6次/d處理間無顯著差異(0.05, 圖1e); 4個處理組間的基因表達水平呈現先下降后上升的趨勢, 4次/d處理組表達水平最低, 且與2次/d、6次/d兩處理組存在顯著差異(0.05, 圖1f)。

圖1 投喂頻率對凡納濱對蝦肝胰腺組織HK、PFK、GAPDH、PK、FBP、PEPCK基因表達的影響

凡納濱對蝦肝胰腺組織中葡萄糖轉運蛋白1 (glucose transporter type 1,)、葡萄糖轉運蛋白2 (glucose transporter type 2,)隨投喂頻率的變化如下:的表達水平隨著投喂頻率的增加而上升, 但處理間差異不顯著(>0.05, 圖2a); 2、3、6次/d處理組基因表達水平顯著高于4次/d處理組(<0.05), 2、3、6次/d處理組間無顯著差異(圖2b,>0.05)。

圖2 投喂頻率對凡納濱對蝦肝胰腺組織GLUT1、GLUT2基因表達的影響

2.2 投喂頻率對凡納濱對蝦PI3K信號通路表達的影響

隨著投喂頻率的增加, 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,)蛋白激酶B (protein kinase B,)雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,)缺氧誘導因子1α亞基(hypoxia- inducible factor 1a,)幾種基因的表達水平均呈現上升趨勢(圖3)。6次/d處理組PI3K信號通路相關基因的表達水平均顯著高于2次/d處理組(0.05)其中,表達水平在6次/d處理組顯著高于2次/d和3次/d處理組(0.05), 2、3、4次/d處理間無顯著差異(0.05, 圖3a);的表達水平僅2次/d與6次/d處理組間存在顯著差異(0.05, 圖3b); 6 次/d處理組表達水平顯著高于2次/d處理組(0.05), 3次/d和4次/d處理組與2、6次/d處理間均無顯著差異(0.05, 圖3c); 4、6次/d處理組的表達水平均顯著高于2次/d處理組(0.05, 圖3d)。

3 討論

3.1 投喂頻率對凡納濱對蝦糖代謝酶基因表達水平的影響

代謝是營養物質在生物體內所經歷的一切化學變化的總稱, 是機體內維系生長和繁殖等生命活動重要特征之一。對蝦通過攝食獲得的葡萄糖通過糖酵解、TCA循環等方式徹底氧化分解成能量之后, 繼而進行一切生命活動(李雪鶴, 2020)。其中,、、是糖酵解反應中的關鍵調節酶, 其活性變化對于維持糖酵解速率具有重要作用(Jenkins, 2011; 李英等, 2012)。本研究發現, 隨著投喂頻率的增加,、幾種糖酵解酶基因的表達水平顯著提高, 說明投喂頻率的增加會提高糖酵解水平。推測投喂頻率較低時, 對蝦空胃時間較長, 造成血糖濃度維持時間較短, 提高投喂頻率促進對蝦對糖原的利用, 促進糖酵解水平, 從而增強代謝活動。楊品賢等(2018a)也得到了相似的結論, 0.37～2.67 g凡納濱對蝦在5次/d、7次/d投喂組肝胰腺HK、PFK 活性顯著高于2次/d投喂組, 而PK活性無顯著差異。對魚類的研究發現投喂頻率由2次/d增加至4次/d時, 鯉魚()肝胰臟基因表達顯著提高, PFK和PK酶活性也隨之升高, 但差異并不顯著(范澤, 2017)。其他研究發現, 凡納濱對蝦糖代謝的表達水平會受到多種因素的影響。比如溫度變化, 當水溫從17 °C突變為27 °C, 凡納濱對蝦肝胰腺組織中HK和PK活力顯著升高, 分別在3 h、6 h達到頂點, 驟然升溫加速了糖酵解途徑反應(Guo, 2010)。還有鹽度變化(Esparza-Leal, 2019), 當鹽度從30下降到24和22, 凡納濱對蝦肝胰腺HK和PK活力顯著升高, 通過糖酵解調節血糖水平來保證滲透調節所需的能量(李英等, 2012)。此外, 凡納濱對蝦糖代謝水平還會受到水體氮水平的影響, 在慢性亞硝酸氮脅迫時, 凡納濱對蝦通過調節肝胰腺中糖酵解水平做出短期響應(肖威等, 2020)。在氨氮脅迫時, 血淋巴中葡萄糖和乳酸含量也隨之升高, 代謝活動增強(Cui, 2017; Long, 2021)。這些發現進一步驗證凡納濱對蝦可以通過糖代謝變化來應對環境變化、維持機體內外穩態。其他水產養殖物種中糖代謝水平也會受到密度和餌料糖水平等因素的影響。例如, 中國明對蝦()在較高密度養殖時HK、PK活性增加, 糖酵解速率提高(張海恩等, 2021)。斑節對蝦()日糧中添加不同種類碳水化合物, 其中添加小麥淀粉的蝦HK和G6PDH活性最高, 生長性能也最好, 說明小麥淀粉提高斑節對蝦糖酵解水平, 促進生長, 是更好的碳水化合物來源(Niu, 2012)。日本沼蝦日糧中添加淀粉, 肝胰腺HK和PFK活性顯著升高, 表現出更高的糖代謝水平和生長性能(Kong, 2019)。

圖3 投喂頻率對凡納濱對蝦肝胰腺組織PI3K、Akt、HIF1-a、mTOR基因表達的影響

糖異生是乳酸、丙酮酸等非糖物質合成葡萄糖的過程。有報道指出肝臟是機體進行糖異生過程的主要器官, 其次是腎臟和腸道(Kirchner, 2008; 馬紅娜等, 2016; 韓錦鉑等, 2019)。PEPCK被認為是肝糖異生途徑關鍵酶之一, 而FBP參與肝胰腺組織中糖異生或戊糖磷酸途徑的激活(Cota-Ruiz, 2015)。它們在機體內源性葡萄糖的合成、輸出及調控中發揮重要作用。有研究發現鯉魚提高投喂頻率肝胰臟PEPCK及GS活性顯著升高(范澤, 2017)。本研究發現在高頻率投喂處理組(6次)時, 糖異生相關酶基因和表達水平顯著上調, 說明糖異生過程增強。同時在本實驗中還發現: 糖酵解中關鍵的限速酶的表達也顯著增高。糖異生與糖酵解水平同時提高, 這說明在不同投喂頻率條件下糖異生、糖酵解酶基因可能協同發揮作用, 最終調節葡萄糖在糖異生、糖酵解二者間的動態平衡(李榮翠等, 2018; 詹秋羽等, 2020)。此外, 糖異生酶還與攝入糖種類有關。在大菱鲆()中發現, 糊精糖源抑制FBP和PEPCK糖異生酶活性的表達, 但蔗糖糖源對FBP和PEPCK酶活性影響差異不顯著(聶琴等, 2013)。

葡萄糖不能直接進入細胞發揮作用, 在這個過程中需要轉運蛋白的參與。其機制是高度親水葡萄糖借助通過鑲嵌在細胞膜上的轉運蛋白才可以通過疏水性生物膜從而進入細胞, 參與代謝。相關研究指出,在凡納濱對蝦中屬于較為保守的一種蛋白, 表達受飼料糖水平、糖源的影響(王曉丹, 2017)。另有研究發現在斑節對蝦()中的表達存在組織差異, 其規律是鰓>肝胰腺>卵巢(何鵬等, 2019)。本實驗發現, 不同投喂頻率下凡納濱對蝦肝胰腺組織中表達趨于穩定。是雙向葡萄糖轉運蛋白, 順濃度梯度轉運蛋白, 在哺乳動物和昆蟲中都是促進性葡萄糖轉運蛋白的標志(Zhao, 2007; Kikuta, 2010; Martínez- Quintana, 2015)。本實驗發現高投喂頻率下肝胰腺組織的表達水平顯著增加, 說明可能在肝胰腺中發揮主要作用。范澤(2017)也在鯉魚中發現4次/d投喂組肝胰腺表達水平顯著高于2次/d投喂組。因此, 高頻率投喂下凡納濱對蝦肝胰腺組織中增多, 會加速葡萄糖進入細胞, 充分參與代謝, 從而促進生長。

高頻率投喂(6次)加速凡納濱對蝦糖的分解與合成, 導致糖代謝活躍。這是由于在較高投喂頻率下對蝦在代謝周期縮短、胃腸排空速度加快, 從而增加了營養物質的攝取(楊品賢等, 2018b)。

3.2 投喂頻率對凡納濱對蝦PI3K信號通路表達的影響

糖代謝過程受到信號通路相關因子的調控。其中PI3K是經典的糖代謝信號通路, 激活的PI3K催化生成第二信使并激活Akt、mTOR、HIF-1α等下游分子, 實現多種信號因子的傳導, 最終調節糖異生、脂肪酸合成及葡萄糖轉運等過程(DeBerardinis, 2008; 遲毓婧等, 2010; Courtnay, 2015)。在葡萄糖供應充足的情況下, 該通路能夠促進的表達, 增強HK、PFK的活性(Buzzai, 2005; Cárdenas-Navia, 2008)。本研究發現, 在較高投喂頻率下凡納濱對蝦肝胰腺組織中PI3K信號通路相關因子(、、)的表達顯著增高, 說明高頻率投喂會激活PI3K-Akt信號通路。哺乳動物中已經證實PI3K-Akt信號通路和糖代謝關鍵酶之間存在調控關系, 可以影響葡萄糖的轉運, 通過誘導的表達, 進一步影響磷酸果糖激酶等代謝酶(Li, 2020), 本實驗中高頻率投喂組的高表達, 可能體現高頻率投喂下利用升高來介導2的表達, 從而控制葡萄糖進入細胞的速率調節糖代謝(Cui, 2018)。PI3K信號通路還可以通過調控的表達來影響靶基因等糖酵解酶基因的表達水平(Yalcin, 2009; Dang, 2012)。雖然在對蝦中PI3K信號通路和糖代謝關鍵酶之間關系的研究還較匱乏, 但在凡納濱對蝦中發現干擾基因后,表達水平顯著下降, HK和G6PDH酶活力顯著下降, 在WSSV感染后借由增加關鍵糖酵解基因的表達來調節糖酵解過程(Godoy-Lugo, 2019)。另外, 在脅迫條件下(低氧)凡納濱對蝦借由調控、和等基因轉錄水平來調節機體內的葡萄糖代謝(Cota-Ruiz, 2016; Camacho-Jiménez, 2019)。本實驗也發現隨著投喂頻率的增加的表達水平不斷升高, 同時糖代謝過程中關鍵基因也相應升高, 說明高頻率投喂下激活的PI3K通路, 通過調控關鍵的糖代謝酶基因和糖轉運過程參與調節糖代謝過程。

4 結論

本實驗通過研究不同投喂頻率對凡納濱對蝦的糖代謝及相關信號通路的影響, 發現在高投喂頻率(6次/d)下, 可以通過激活凡納濱對蝦糖代謝酶基因, 使其肝胰腺組織糖酵解、糖異生酶、糖轉運蛋白及糖代謝PI3K信號通路相關因子的基因表達水平顯著升高, 糖代謝能力增強, 本實驗結果可以為進一步研究凡納濱對蝦健康養殖提供科學數據參考。

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EFFECTS OF FEEDING FREQUENCY ON EXPRESSION OF GENES RELATED TO METABOLISM AND PI3K SIGNALING PATHWAY IN

ZHAO Nan-Nan, CUI Yan-Ting, WANG Zhong-Kai, WANG Cong, ZHANG Zhi-Hao, DENG Zhi-Tong, ZHAO Rui-Yang, SUN Jin-Feng, WANG Ren-Jie, LI Yu-Quan

(School of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

To investigate the effects of different feeding frequencies on glucose metabolism and related signaling pathways in, the PI3K signaling pathways (,,, and), metabolic enzyme (,,,,, and), and glucose transporters(and) mRNA expression in the hepatopancreas were determined. Shrimps [(7.6±1.0) g] were randomly distributed in four-frequency feeding treatments (2×/d, 3×/d, 4×/d, and 6×/d) in triplicate. The experiment lasted for 14 days. Results show that the expression levels of key genes in PI3K signaling pathway increased significantly at higher frequencies (0.05). The expression levels of,,,andin 6×/d were significantly higher than those of 2×/d (0.05), and the expression level ofin 4×/d was significantly higher than those of 2×/d (0.05). The expression levels of,,,,,andincreased with the increase in feeding frequency. The expression levels of glycolyticgenes,,,andin 6×/d group were significantly higher than those of 2×/d (0.05). The expression levels of gluconeogenic enzymein 3×/d, 4×/d, and 6×/d groups were significantly higher than those of 2×/d (0.05). Glucose transporterin 2×/d, 3×/d, and 6×/d was significantly higher than those of 4×/d (0.05). Therefore, higher feeding frequency could improve glucose metabolism by activating glucose metabolism enzyme, glucose transporter and PI3K signaling pathway in.

; feeding frequency; glucose metabolism enzyme; glucose transporter; PI3K signaling pathway

Q789; S968

10.11693/hyhz20211200336

*山東省蝦蟹產業技術體系, SDAIT-15-011號; 山東省農業科技資金(園區產業提升工程)項目, 2019YQ003號; 國家自然科學基金項目, 31802269號; 山東省自然科學基金項目,ZR2019BC013號。趙楠楠, 碩士研究生, E-mail: 18893078465@163.com; 同等貢獻第一作者: 崔彥婷, 博士, 講師, E-mail: yt-cui1114@163.com

李玉全, 博士, 教授, 碩士生導師, E-mail: jiangfangqian@163.com

2021-12-23,

2022-02-19