羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)初次性成熟性腺發育的組織學觀察*

陳國柱 鐘鎮霄 楊旻珉 邢錢錢 夏正龍 唐瓊英① 易少奎 蔡繆熒 楊 杰 楊國梁, ①

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)初次性成熟性腺發育的組織學觀察*

陳國柱1鐘鎮霄1楊旻珉1邢錢錢1夏正龍2唐瓊英1①易少奎1蔡繆熒2楊 杰2楊國梁1, 2①

(1. 湖州師范學院 浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室 中國水產科學研究院水生動物繁育與營養重點實驗室 浙江湖州 313000; 2. 江蘇數豐水產種業有限公司 江蘇高郵 225654)

性腺發育是羅氏沼蝦()個體生長及繁育的重要生物學過程, 是良種培育的基礎。采用外部形態觀察及常規石蠟切片的方法, 分析了羅氏沼蝦初次性成熟過程中性腺外部形態及內部組織學變化的規律。結果表明, 性腺顏色、體積及細胞組成、分布均隨性腺發育表現出規律性變化, 卵巢發育劃分為8個時期, 精巢發育分為4個時期。卵巢外部形態發育與內部組織學變化同步性高, 隨卵巢成熟度增加, 不同階段生殖細胞由生發區向外形成環狀分區, Ⅰ～Ⅲ期卵巢體積、生殖細胞大小及性腺指數(GIS)增長緩慢, 主要進行生殖細胞數量積累, Ⅳ～Ⅶ期卵巢體積、生殖細胞大小及GIS增長迅速, 生殖細胞在增殖同時, 營養物質積累迅速?？筛鶕殉差伾?、體積、色素分布等推測其內部組織細胞的發育情況。精巢形態發育和組織發育同步性較差, 精巢體積、生殖細胞大小、種類及GIS在精巢成熟過程中變化較小, Ⅰ期精巢主要進行個體生殖功能的完善, Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期精巢則整體表現為個體生殖能力的強化過程。研究結果豐富了羅氏沼蝦繁殖生物學內容, 從形態及組織學方面初步探明了羅氏沼蝦性腺的基本發育過程, 可為其良種選育和蝦苗繁育提供參考依據。

羅氏沼蝦; 精巢; 卵巢; 周期劃分; 性成熟

羅氏沼蝦(), 又稱馬來西亞大蝦、淡水長臂蝦, 隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬()。該蝦棲息于熱帶、亞熱帶地區的咸水及半咸水水域, 是世界上個體最大的淡水蝦。因其生長快、食性廣等優良養殖及商業特性而被廣泛養殖(潘家模, 1994)。我國羅氏沼蝦養殖產量現已占世界總產量的60%左右, 成為羅氏沼蝦養殖第一大國(FAO, 2020)。生長與繁殖性能是最重要的兩個生物學指標, 隨著我國羅氏沼蝦產業的迅速發展, 加強羅氏沼蝦基礎生物學研究顯得尤為重要。

目前對甲殼類動物性腺發育相關研究主要集中在以下幾方面: 組織學上, 各學者將性腺外部形態與內部組織結構相結合, 對波紋龍蝦() (劉慧玲等, 2009)、克氏原螯蝦() (黃文虎, 2012)、凡納濱對蝦() (顏素芬等, 2004)、中華絨螯蟹() (薛魯征等, 1987; 堵南山等, 1988)、鋸緣青蟹() (上官步敏等, 1991)等的卵巢或精巢的發育周期進行了劃分, 并探索其生殖細胞的發生過程; 內分泌學上, 羅氏沼蝦的性腺發育通常與其眼柄的X器官竇狀腺復合體、Y器官及大顎器官分泌的多種蛻皮及性腺發育相關的激素相結合進行研究(蔡生力, 1998; 朱小明等, 2001; Felterman, 2011);行為學上, 研究者對克氏原螯蝦(徐增洪, 2014)、羅氏沼蝦(王春等, 2009; Habashy, 2013)、日本沼蝦() (徐紅艷, 2001)等求偶、交媾前后、產卵等繁殖行為進行了系統的觀察描述, 雄蝦在性成熟后繁殖交配季節表現出明顯的占區、求偶等行為。形態學方面, 邢錢錢等(2021)發現羅氏沼蝦雌蝦性成熟后可能通過頭胸甲和腹部形態性狀的變化增強其個體繁殖力; 與其類似, Chow等(1991)發現凡納濱對蝦性成熟后雌蝦的頭胸甲寬顯著大于雄蝦; Primavera等(1998)認為斑節對蝦()在仔蝦時期雌雄個體規格及生長表現相似, 只在雌蝦性成熟后表現出性二態性。以上研究表明性腺發育過程往往伴隨著外部形態的變化。繁殖生物學方面, 胡潤豪等(2021)認為長臂蝦類產卵量受卵巢發育狀況的影響。在分子機制方面, 姜虎成(2015)通過轉錄組分析了部分基因在克氏原螯蝦性腺不同發育時期的調控機制和表達情況; 江紅霞(2017)在日本沼蝦中發現卵黃蛋白原()、組織蛋白酶L ()、半胱氨酸蛋白酶抑制因子()等12個可能與日本沼蝦性早熟密切相關基因。除上述研究外, 許多學者還通過人為調控如營養(Jover, 1999; Carmona-Osalde, 2005)、養殖密度(戴習林等, 2016a, 2016b)、光照(張龍崗等, 2014)等外部環境因素探索了外界環境變化對甲殼類動物性腺發育的影響。

羅氏沼蝦由仔蝦發育至成蝦, 達到初次性成熟這一階段生長較快, 性腺發育與生長是同步進行的, 整個過程包含了復雜的行為、外部形態及性腺形態的變化。趙云龍等(1998)的研究表明, 羅氏沼蝦的雌性生殖系統包括卵巢和輸卵管, 根據卵黃積累情況將卵子發生過程大致分為5期。王玉鳳等(1997)對羅氏沼蝦雄性生殖系統進行了結構劃分, 并探索了生殖細胞發育過程中RNA、DNA及蛋白質合成和分布規律。朱春華等(2011)研究表明羅氏沼蝦仔蝦后15 d出現生殖原基, 外部性征分化略早于內部性征分化, 這與戴習林等(2016b)對性別分化及性腺原基出現時間的研究結論一致。這些研究結果使我們對羅氏沼蝦的生殖系統結構、性腺發育過程等有了初步認識, 但對雌蝦卵巢發育的外部形態與內部組織學變化規律的對應關系研究還不夠深入, 對雄蝦精巢的發育規律也未準確闡明, 對羅氏沼蝦性腺發育過程的認識還需進一步深入。從能量分配的角度考慮, 若不能滿足羅氏沼蝦初次性腺發育及生長所需營養, 羅氏沼蝦后期的生長、繁殖性能將會受到嚴重的影響。

因此, 研究羅氏沼蝦性腺發育的基本規律, 掌握羅氏沼蝦繁殖及生長的關鍵節點, 對增強親蝦繁殖力、提高育苗成活率、保證商品蝦生長的營養供給意義重大。本研究基于前人對蝦蟹類物種性腺發育的研究方法, 將性腺外部形態與其組織學相結合進行觀察, 對羅氏沼蝦初次性成熟性腺外部形態及組織學變化規律進行系統研究, 以期進一步完善羅氏沼蝦的繁殖生物學資料, 助力羅氏沼蝦的產業發展。

1 材料與方法

1.1 實驗用蝦

實驗用羅氏沼蝦()來自江蘇數豐水產種業有限公司育種中心淡化時間相同的9個家系仔蝦, 個體規格(2.9±0.16) g, 每個家系挑選200個個體, 保證雌雄比1︰1左右, 共計1 800尾仔蝦用于本實驗養殖取樣。實驗用蝦取樣時間段為2020年8月1日～10月4日。

1.2 飼養管理

將每個家系的200尾仔蝦分別置于9個面積為17 m2的水泥池飼養, 初期養殖密度約為12 尾/m2。各池的光照(0～1 380 lx)、水溫(28～32 °C)等養殖條件一致, 投喂飼料由江蘇富裕達糧食制品股份有限公司供應, 日投喂量為每池蝦總重的8%～10%, 分別于早上8:00、下午4:00及晚上10:00分3次進行投喂。養殖中后期除投喂人工飼料外, 適當增投螺螄肉(按每次配合飼料投喂量的4～5倍投喂)進行強化培育。水質指標保持在: pH 7.5～8.0、溶氧8～11 mg/L、氨氮0.05～0.25 mg/L、亞硝酸鹽0.1～0.3 mg/L。

1.3 取樣及測量

以7 d為一周期, 分池飼養后即對各池進行采樣, 每個家系隨機捕撈雌雄各3尾, 9個池共取54尾, 實驗共取樣10個周期。將待取樣蝦置于冰上10 min以降低其活力, 對每尾蝦的頭胸甲背面進行拍照后解剖, 對性腺進行拍照、取樣、稱性腺重(gonadal weight, GW), 計算性腺指數(gonadal index, GIS), 并選取厚度約0.2～0.5 cm的性腺組織采用4%組織固定液固定, 定期更換固定液以便長期保存, 供后續組織切片觀察分析。

1.4 切片制作、H.E染色及拍照測量

采用常規石蠟切片的制作流程及蘇木精-伊紅(H.E)染色方法研究性腺的組織學(趙惠玲等, 2004; 楊捷頻, 2006)。性腺外部形態在體式解剖鏡下觀察并拍照, 性腺組織結構特征通過組織切片在顯微鏡下觀察并拍照, 拍攝圖片導入Photoshop CS6, 使用標尺工具校準原圖標尺后進行細胞長短徑測量。

1.5 性腺發育分期

性腺的解剖觀察側重于通過解剖后肉眼觀察結合解剖鏡觀察性腺外部形態結構(體積、顏色、表面色素覆蓋程度等), 而組織學觀察則側重于通過切片觀察性腺內部細胞種類、各類細胞所占比率及排布狀態。本研究基于性腺的解剖觀察與組織學觀察綜合變化情況對性腺進行發育時期的劃分。

2 結果

2.1 卵子發生

根據羅氏沼蝦卵巢切片觀察卵細胞發育時相, 發現其卵細胞的大小、H.E染色變化、卵黃物質積累、各類細胞在卵巢中的分布存在規律性變化。此過程中的卵細胞存在5個發育時期, 即: 卵原細胞、卵黃合成前期卵母細胞、內源性卵黃合成期卵母細胞、外源性卵黃合成期卵母細胞及成熟卵細胞。

卵原細胞: 細胞呈不規則圓形, 長徑9～11 μm, 短徑7～9 μm; 整個細胞被細胞核占據大部分, 核呈嗜堿性, 核仁不明顯, 胞質染色淺, 均勻分布于細胞核周圍, 整個細胞幾乎跟細胞核顏色一致。

卵黃合成前期卵母細胞: 卵原細胞隨著卵巢發育, 體積逐漸增大, 由生發區向外推移形成卵黃合成期卵母細胞, 形狀不規則, 長徑28～32 μm, 短徑20～24 μm; 細胞核圓形, 核仁部分可見, 圓形, 1～2個,呈強嗜堿性, 細胞質較卵原細胞增多, 呈藍紫色。

內源性卵黃合成期卵母細胞: 細胞形狀為橢圓或不規則多邊形, 長徑40～48 μm, 短徑30～36 μm; 核質分區明顯, 細胞核圓形, 染色質呈藍色, 胞質由嗜堿性轉變為嗜酸性, 呈深紅色。

外源性卵黃合成期卵母細胞: 細胞體積迅速增大, 早期長徑88～93 μm, 短徑71～76 μm; 細胞核呈卵圓形, 部分細胞已形成單個較大核仁, 呈嗜堿性, 核質同樣呈嗜堿性, 細胞質內出現脂滴顆粒, 到發育后期胞質內脂滴顆粒數目明顯增多, 體積約早期的2倍。長徑220～240 μm, 短徑116～138 μm, 顆粒大小增大, 細胞核開始出現不規則形狀。

成熟卵細胞: 細胞體積達到最大, 長徑400～ 480 μm, 短徑220～270 μm, 中間充斥著大量脂滴, 單個細胞之間已難以區分界限, 核仁在視野內幾乎消失, 卵細胞透過卵巢肉眼可見, 羅氏沼蝦即將蛻殼抱卵。

2.2 卵巢發育分期

解剖發現, 卵巢由左右兩葉構成, 前端閉合, 呈倒V字型。處于增殖期的卵巢覆蓋于羅氏沼蝦心臟的下方, 肝胰腺的后上方。卵巢解剖結構觀察與組織學觀察的變化表現出一一對應的高同步性, 可根據卵巢占羅氏沼蝦體重的比率(性腺指數)、卵巢的體積、顏色(表面色素覆蓋程度), 以及卵巢內細胞種類的組成、分布情況, 將卵巢發育過程分為以下8個時期。

Ⅰ期卵巢(增殖期): 該期卵巢體積極小且受到血淋巴的影響, 肉眼觀察極難分辨該期卵巢的形態和顏色。解剖鏡觀察, 卵巢已隱約區分左右兩葉, 前端閉合處延伸至整個肝胰腺背面約1/7處, 最大寬度小于心臟寬度, 顏色接近透明, 卵巢背面無色素覆蓋(圖1a)。切片觀察, 卵巢中的細胞主要由卵原細胞和濾泡細胞組成, 存在極少數排列在卵巢外圍發育初期的卵母細胞(圖2a)。卵巢性腺指數0.16%。

Ⅱ期卵巢(發育前期): 肉眼觀察, 卵巢體積較增殖期增加2～3倍, 已可見卵巢輪廓。解剖鏡觀察, 卵巢前端閉合處向肝胰腺前端緩慢延伸至1/5～1/4處, 最大寬度接近心臟寬度。整體顏色呈半透明乳白色, 背面較增殖期于前端閉合處和中端開始出現少量黑色素覆蓋(圖1b)。切片觀察, 卵原細胞集中分布在卵巢的中心區域(生發區), 外周卵黃合成前期卵母細胞數目明顯增加, 濾泡細胞開始由卵巢生發區向外遷移, 表現圍繞卵母細胞形成單個濾泡腔的趨勢(圖2b)。卵巢性腺指數0.18%。

Ⅲ期卵巢(發育中期): 肉眼觀察, 卵巢體積較發育前期增加約2倍, 卵巢整體呈乳白色。解剖鏡觀察, 前端閉合處已延伸覆蓋至整個肝胰腺的1/3處, 最大寬度已超過心臟寬度, 左右兩葉卵巢背面出現1條黑色素帶, 覆蓋了整個卵巢背面約2/3面積(圖1c)。切片觀察, 卵巢中心仍主要為卵原細胞, 其外周環繞了大量卵黃合成前期卵母細胞。此外, 在卵黃合成前期卵母細胞外周出現了部分內源性卵黃合成期卵母細胞, 數量較卵黃合成前期卵母細胞少, 濾泡細胞已基本環繞于單個卵母細胞周圍形成濾泡腔(圖2c)。性腺指數0.21%。

Ⅳ期卵巢(發育后期): 肉眼觀察, 卵巢體積進一步增大, 卵巢整體呈乳白色。解剖鏡觀察, 前端閉合處延伸至肝胰腺背面約2/3處, 最大寬度較發育中期更寬, 卵巢內隱約可見少量乳黃色區域, 其背面色素帶未見明顯變化(圖1d)。切片觀察, 整個卵巢可分為中心區、外圍1區、外圍2區三個區域, 中心為生發區, 以卵原細胞為主, 外圍2區為卵巢最外圍, 分布大量內源性卵黃合成期卵母細胞。外圍1區在中心區和外圍2區之間, 以卵黃合成前期卵母細胞為主。觀察區域面積大小發現, 外圍2區>外圍1區>中心區。此外, 環繞在單個濾泡腔周圍的濾泡細胞有增加趨勢(圖2d)。性腺指數0.34%。

圖1 羅氏沼蝦卵巢不同發育時期解剖鏡下外部形態觀察

注: a. 增殖期卵巢; b. 發育前期卵巢; c. 發育中期卵巢; d. 發育后期卵巢; e. 發育末Ⅰ期卵巢; f. 發育末Ⅱ期卵巢; g. 成熟期卵巢; h. 退化期卵巢。O: 卵巢; M: 黑色素; Me: 成熟卵子

Ⅴ期卵巢(發育末Ⅰ期): 肉眼觀察, Ⅴ期的卵巢體積雖在增加, 但增長幅度不大, 整個卵巢呈明顯的乳黃色。解剖鏡觀察, 卵巢背面色素帶明顯, 色素分布區域明顯增加(圖1e)。切片觀察, 卵巢可分為中心區、外圍1區、外圍2區、外圍3區共4個區域, 主要細胞類型分別為卵原細胞、卵黃合成前期卵母細胞、內源性合成期卵母細胞、外源性合成早期卵母細胞; 各區域大小為: 外圍3區>外圍2區>外圍1區>中心區。從該階段開始, 環繞在單個濾泡腔周圍的濾泡細胞數目迅速增加(圖2e)。性腺指數0.49%。

圖2 羅氏沼蝦卵巢不同發育時期組織學特征

注: a. 增殖期卵巢(×100); b. 發育前期卵巢(×100); c. 發育中期卵巢(×100); d. 發育后期卵巢(×100); e. 發育末Ⅰ期卵巢(×100); f. 發育末Ⅱ期卵巢(×40); g. 成熟期卵巢(×40); h. 退化期卵巢(×40)。OG: 卵原細胞; PR: 卵黃合成前期卵母細胞; EN: 內源性卵黃合成期卵母細胞; EX1: 外源性卵黃合成前期卵母細胞; EX2: 外源性卵黃合成中、晚期卵母細胞; MO: 成熟卵子; FC: 濾泡細胞; FC1: Ⅰ型濾泡細胞; FC2: Ⅱ型濾泡細胞; NL: 細胞核; Y: 卵黃顆粒; BS: 血竇; 0: 中心區; 1: 外圍1區; 2: 外圍2區; 3: 外圍3區; 4: 外圍4區

Ⅵ期卵巢(發育末Ⅱ期): 肉眼觀察, 卵巢體積迅速增長且橫向增長明顯, 卵巢呈金黃色。解剖鏡觀察, 卵巢表面色素帶斑點變得愈發致密, 且顏色開始向墨綠色轉變(圖1f)。切片觀察, 卵巢可按照第Ⅴ期類似的區域劃分方式分為中心區、外圍1區、外圍2區、外圍3區、外圍4區共5個區域, 主要細胞類型分別為卵原細胞、卵黃合成前期卵母細胞、內源性卵黃合成期卵母細胞、外源性卵黃合成早期卵母細胞、外源性卵黃合成中、晚期卵母細胞; 各區域大小為: 外圍4區>外圍3區>外圍2區>外圍1區>中心區。以成熟度為標準, 卵原細胞、卵黃合成前期卵母細胞、內源性卵黃合成期卵母細胞由卵巢中心向外呈單條脊索狀依次排列, 整個卵巢呈輻射型向外發育, 越靠近卵巢膜, 成熟度越高(圖2f)。性腺指數0.77%。

Ⅶ期卵巢(成熟期): 肉眼觀察, 卵巢體積增至整個發育期的最大。其前葉最遠可覆蓋整個肝胰腺、胃, 延伸至羅氏沼蝦的額劍處, 整體呈桔黃色。解剖鏡觀察, 其背面的黑色素轉變為墨綠色, 覆蓋了整個卵巢背面, 透過極薄的卵巢外膜隱約可見卵巢內部呈卵圓形的成熟卵子(圖1g)。切片觀察, 視野下主要為成熟卵母細胞, 外源性卵黃合成期卵母細胞極少, 內源性卵黃合成期卵母細胞消失, 卵巢中心區存在少量卵原細胞和卵黃合成前期卵母細胞(圖2g)。性腺指數5.7%。

Ⅷ期卵巢(退化期): 肉眼觀察, 卵巢干癟, 體積較小, 顏色趨近半透明, 在肝胰腺背面的覆蓋程度接近Ⅲ期卵巢。解剖鏡觀察, 黑色素帶的覆蓋程度與Ⅵ期卵巢接近, 幾乎覆蓋了整個卵巢背面, 色素重新轉變為黑色(圖1h)。切片觀察, 卵巢內細胞種類主要包括卵原細胞、卵黃合成前期卵母細胞、內源性卵黃合成期卵母細胞、濾泡細胞4類, 由卵巢中心生發區向卵巢膜分布, 在內源性卵黃合成期卵母細胞之間可看到大量已排出成熟卵子的濾泡空腔和濾泡細胞(圖2h)。性腺指數0.63%。

羅氏沼蝦卵巢發育各時期性腺指數的變化趨勢如圖3, 雌蝦的性腺指數因其發育時期的不同存在一個先緩慢增加, 至Ⅵ～Ⅶ期迅速增加, 而Ⅶ～Ⅷ期迅速下降的過程。

圖3 羅氏沼蝦不同卵巢發育時期性腺指數(GIS)變化規律

2.3 精巢形態學及組織學

羅氏沼蝦的精巢與卵巢的位置一致, 位于心臟下方, 肝胰腺后上部。整個精巢由許多生精小管組成, 覆蓋于肝胰腺上。精巢解剖觀察結果與組織學觀察的同步性較差, 外部形態和內部組織學變化表現出存在一定關聯性但又相對獨立的變化過程。根據精巢發育過程中體積、顏色、表面色素覆蓋程度、精巢內細胞種類的組成結構差異將其分為4個發育時期。

Ⅰ期精巢: 肉眼觀察, 因受到血淋巴的影響, 極難分辨。解剖鏡觀察, 該期精巢較小, 半透明, 前端閉合, 后端分離, 整個精巢呈V型。精巢表面無色素覆蓋, 精巢末端無法從解剖鏡下觀察到明顯的輸精管(圖4a)。切片觀察, 精巢中精原細胞占絕大部分, 細胞之間排列緊密, 生精小管之間夾雜著極少量的營養細胞(圖5a)。性腺指數0.17%。

Ⅱ期精巢: 肉眼觀察, 已可見精巢組織, 顏色呈半透明乳白色, 精巢前端與胃后緣之間存在一透明膜狀組織粘連, 將整個精巢拉長至胃的末端。解剖鏡觀察, 精巢表面存在少量黑色素斑點, 單側精巢明顯變粗, 末端隱約可見輸精管(圖4b)。切片觀察, 營養細胞圍繞在單個生精小管邊緣排布, 不同發育時期的生殖細胞可同時存在于同一生精小管中且彼此分界并不明顯, 生殖細胞總數有所增加(圖5b)。性腺指數0.23%。

Ⅲ期精巢: 肉眼觀察, 精巢體積較發育初期有進一步增長, 精巢兩葉進一步增粗; 精巢整體呈乳白色。解剖鏡觀察, 背面覆蓋的黑色素斑點呈線狀排列, 且黑色素斑點數量增多, 單個斑點覆蓋面積增大, 精巢后端的輸精管已清晰可見(圖4c)。切片觀察, 精原細胞所占比例較發育初期明顯減少, 而精細胞所占比例明顯增多, 且存在一定數量的精細胞正在轉變為成熟精子的變態過程。整個精巢的細胞數量隨著精巢的不斷發育也有明顯增多的趨勢(圖5c)。性腺指數0.23%。

圖4 羅氏沼蝦精巢不同發育時期解剖鏡下外部形態觀察

注: a. Ⅰ期精巢; b. Ⅱ期精巢; c. Ⅲ期精巢; d. Ⅳ期精巢。T: 精巢; M: 黑色素; Vd: 輸精管

圖5 羅氏沼蝦精巢不同發育時期組織學特征

注: a. Ⅰ期精巢(×100); b. Ⅱ期精巢(×100); c. Ⅲ期精巢(×100); d. Ⅳ期精巢(×100)。GE: 生殖上皮; SG: 精原細胞; SC1: 初級精母細胞; SC2: 次級精母細胞; ST: 精細胞; S: 精子; NC: 營養細胞; CT: 結締組織; GE: 生殖上皮

Ⅳ期精巢: 肉眼觀察, 成熟期的精巢體積增至最大, 顏色乳白色。解剖鏡觀察, 兩葉精巢表面如桑葚狀凹凸不平, 其表面覆蓋的黑色素斑點因精巢的乳白色而顯得更深。精巢末端盤曲著大團輸精管(圖4d)。精巢中生殖細胞包括了精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞、成熟精子五類, 生殖細胞總數此時達到最大, 精細胞與成熟精子混雜在一起分布于生精小管一側(圖5d)。性腺指數0.26%。

羅氏沼蝦精巢生殖細胞發育各時期性腺指數的變化趨勢如圖6。雄蝦的性腺指數因其發育時期的不同存在緩慢增加的趨勢, 但增長幅度較小。

圖6 羅氏沼蝦不同精巢發育時期性腺指數(GIS)變化

3 討論

3.1 卵巢發育

國內外學者對甲殼動物的卵巢發育時期劃分標準并不一致, 但存在相似之處。劉慧玲等(2009)按卵巢組織學特征、不同卵細胞發育時期所占比例、卵巢形態及顏色將波紋龍蝦卵巢發育分為6個時期。栗治國等(2014)根據脊尾白蝦()卵巢顏色及卵巢成熟指數將卵巢發育分為6個時期。Guimar?es等(2021)以低平斜紋蟹()卵巢形態、組織結構、各類生殖細胞頻率以及卵巢的位置將卵巢發育過程分為4個時期。Chen等(2019)在紅紋鞭腕蝦()卵巢發育分期中以卵巢長度、顏色為劃分標準。上官步敏等(1991)根據鋸緣青蟹卵巢外部特征及組織學特征將卵巢發育分為未發育期、發育早期、發育期、將成熟期、成熟期和排卵后期?？傮w來說, 國內外學者都將卵巢的外部形態與內部組織結構作為卵巢發育分期的劃分標準。本研究將羅氏沼蝦的卵巢顏色、體積、卵巢表面的色素分布情況等外部特征與卵巢內生殖細胞所處發育階段、各階段細胞比例進行了分析, 同時結合性腺指數的變化將卵巢發育分為8個時期。分析發現卵巢外部形態與內部組織結構的變化相互對應, 因此可以根據卵巢顏色、體積、色素分布情況推測其內部組織細胞發育情況。

此外, 卵巢隨著發育趨于成熟, 其對應的各時期生殖細胞存在特殊分布及排列規律。增殖期卵巢內生殖細胞成團分布, 并未出現一定規律性, 這一現象持續至發育前期。從發育中期開始至發育末期, 各時期生殖細胞圍繞卵巢中心向外表現出規律性排列, 生殖細胞存在由卵巢中心向外逐漸成熟的趨勢, 且不同時期生殖細胞之間出現分區。單個生殖細胞由卵巢中心生發區向外呈脊索狀排列, 不同發育時期的生殖細胞之間可劃分出較為明顯的環狀分區, 各分區的生殖細胞發育階段比較單一, 這一生殖細胞分區現象持續至成熟期消失。何緒剛等(2002)在武湖日本沼蝦卵巢發育研究中提到關于卵巢發育方向的討論, 通過切片組織觀察認為日本沼蝦的卵巢發育是由腹面向背面發生。本研究通過組織切片觀察發現, 羅氏沼蝦的卵巢發育是由中央向四周橫向發生, 可能存在卵巢由腹面向背面發生的趨勢。

3.2 卵子發生

關于甲殼類動物卵子發生階段的劃分標準目前主要有2類, 部分學者先根據卵細胞大小、形態將其分為: 卵原細胞、初級卵母細胞、次級卵母細胞及成熟卵子4個時期, 然后根據生殖細胞內是否出現油滴或卵黃顆粒, 再將次級卵母細胞細分為早、中、晚3個亞期(King, 1948; 薛魯征等, 1987; 樊玉杰, 2005; 黃楷翔等, 2011)。而另一部分學者則以卵細胞是否開始卵黃合成, 將卵子的發生分為卵原細胞期、卵黃蛋白合成前期、內源性卵黃蛋白合成期、外源性卵黃蛋白合成期以及成熟期5個時期(Bomirski, 1976; 上官步敏等, 1991; Minagawa, 1997; 顏素芬等, 2004; 栗治國等, 2014; Guimar?es, 2021)。

本研究參照第2類劃分標準, 結合對應的卵巢發育階段, 將雌蝦卵子發生過程分為5個時期, 且由于外源性卵黃合成期卵母細胞在發育前后體積變化較大, 將外源性卵黃蛋白合成期再細分為早期和晚期2個亞期。在整個卵子發生過程中, 卵巢內的濾泡細胞作為卵細胞發育的營養供給細胞發揮著重要作用。隨著卵子不斷發育成熟, 濾泡細胞由卵巢中央向外遷移, 多個濾泡細胞圍繞單個卵子形成濾泡腔, 且濾泡細胞由早期的近圓形變為長梭形, 這一過程中濾泡細胞與卵子的接觸面積不斷增大。觀察整個卵子發生過程, 這一系列變化似乎與卵黃合成的啟動保持較高的同步性, 推測濾泡細胞對卵子發育及營養物質積累具有重要作用。

3.3 精巢發育

有關甲殼類動物精巢發育周期劃分的研究國內外鮮有報道。栗治國等(2014)以年為周期將脊尾白蝦的精巢發育劃分為休止期、增殖期、成熟期。楊筱珍等(2010)根據日本新糠蝦()精巢組織學及外部性征變化, 將雄性生殖系統發育分為4個時期。堵南山等(1988)將中華絨螯蟹的精巢發育粗略分為休止期和發育期。Souza等(2018)根據美人蝦()精巢的外部特征將精巢發育劃分為成熟期和發育期。羅氏沼蝦的精巢發育分期目前未見報道, 本研究根據精巢外部形態發育特征(精巢體積、顏色、表面色素分布), 將精巢發育時期分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。

在羅氏沼蝦雄蝦性腺初次成熟過程中, Ⅰ期精巢中生殖細胞為單一精原細胞, 不具備產生精子的能力, 其余3個發育期精巢均具備產生成熟精子的能力。這是基于對雄蝦輸精管及精巢的組織學觀察發現, Ⅰ期精巢輸精管內未見成熟精子, 而Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期精巢包含精原細胞在內的所有時期細胞, 雖然各時期細胞所占比例存在較大差異, 但輸精管內均存在成熟精子, 即Ⅱ期至Ⅳ期精巢除精原細胞的增殖外, 成熟精子也在同步生產。由此推測, Ⅰ期精巢外部形態與內部組織學變化保持較高同步性, 主要進行原始生殖細胞的積累、雄性生殖系統功能及結構的完善過程, 而Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期外部形態與內部組織學變化不再完全同步, 精巢外部形態結構與生殖細胞進入一個具有一定關聯性, 但又相對獨立的發育階段。生殖細胞發育周期在精巢內反復循環, 同時精巢、輸精管仍不斷增粗、增長, 產生精子數量不斷增加, 是雄蝦生殖能力的強化過程。雄蝦精巢生殖功能完善后, 精子在精巢不斷產出, 后于輸精管內積累達到一定數量, 待雌蝦卵子成熟后, 隨時可與雌蝦交配繁殖。本研究也發現雄蝦精子成熟過程較雌蝦卵子成熟過程所需時間更短。

此外, 雄蝦的精巢由大量生精小管組成, 在單個生精小管中, 往往精原細胞所在的生發區單獨集中于生精小管一側分布, 切片下觀察單個生精小管之間橫切面中的生發區并不存在集中分布的現象, 可能與精巢從蝦體剝離后進行切片的人為因素導致。切片觀察同一雄蝦精巢, 各生精小管間存在明顯的發育階段的不同步性, 這與許多研究者得出的同一雄蝦不同生精小管內生殖細胞發育不同步的結論一致(蔡生力, 1998; Felterman, 2011), 但總體以某一發育時期生精小管為主導。

4 結論

本研究通過性腺外部形態觀察結合常規石蠟切片觀察的方法, 總結了雌雄羅氏沼蝦初次性成熟卵巢的形態及組織學變化規律。結果表明: 羅氏沼蝦卵巢發育可分為8個時期, 卵巢在營養物質積累時期(Ⅵ～Ⅶ期)體積及內部細胞種類、體積變化明顯; 雄蝦精巢的發育可劃分為4個時期, 精巢體積隨個體生長緩慢增大, 內部細胞種類、體積變化較小。生產上可嘗試通過卵巢顏色、體積等特征間接判斷其所處發育時期, 對卵巢快速發育時期親蝦進行強化培育(投喂配合飼料同時搭配動物性餌料等), 增大初次性成熟親蝦個體規格, 助力種蝦選育及蝦苗生產。

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HISTOLOGICAL OBSERVATION OF GONAD DEVELOPMENT DURING THE FIRST SEXUAL MATURITY OF

CHEN Guo-Zhu1, ZHONG Zhen-Xiao1, YANG Min-Min1, XING Qian-Qian1, XIA Zheng-Long2, TANG Qiong-Ying1, YI Shao-Kui1, CAI Miu-Ying2, YANG Jie2, YANG Guo-Liang1, 2

(1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development; Key Laboratory of Aquatic Animal Genetic Breeding and Nutrition, Chinese Academy of Fishery Sciences; Huzhou University, Huzhou 313000, China; 2. Jiangsu Shufeng Prawn Breeding Co. Ltd., Gaoyou 225654, China)

Gonadal development is an important biological process during growth and reproduction of. To understand the changes in morphology and histology of gonads in early stage of sexual maturity of, the external morphology was observed and analyzed, and conventional paraffin section method was used. Results show that the color and volume of gonads, the composition and distribution of germ cells at different developmental stages displayed a certain regularity of development. The ovarian development could be divided into 8 stages and testis development into 4 stages. The external morphological development of the ovary was highly synchronized with the internal histological changes. As the maturity of the ovary increased, the germ cells in different stages formed a ring-shaped partition outward from the germinal zone. The ovarian volume, germ cell size, and gonadal index (GIS) increased slowly from Stages Ⅰ to Ⅲ, and mainly accumulated the number of germ cells. From Stages Ⅳ to Ⅶ, the ovarian volume, germ cell size, and GIS increase rapidly, and the germ cell proliferation was accompanied by rapid accumulation of nutrients. The developmental stages of germ cells in ovary could be inferred from the color, volume, and pigment pattern of ovary. However, for the testis, the morphology-histology synchrony in development was low. In Stage Ⅰ, testis was developed for improving the individual reproductive function mainly, and in stages Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ for increasing the reproductive capacity. This study enriches the knowledge of reproduction biology of, especially the development process ofgonads in morphological and histological aspects, and provides a reference for new varieties breeding and reproduction of.

; testis; ovary; cycle division; sexual maturity

Q954; S917; S966

10.11693/hyhz20211200350

*國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”重點專項, 2018YFD0901300號; 財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系資助, CARS-48號; 江蘇省科技廳重點研發專項資金(現代農業)項目, BE2019352號。陳國柱, 碩士研究生, E-mail: 810999142@qq.com

楊國梁, 碩士生導師, 研究員, E-mail: ygl0572@163.com; 唐瓊英, 碩士生導師, 研究員, E-mail: tangqy@ zjhu.edu.cn

2021-12-29,

2022-02-19