藜麥秸稈蛋白的結構和功能性質

商海軍，蔣麗君，江本利，姚曉華，閆曉明*，於春*

（1.安徽省農業科學院棉花研究所，安徽 合肥 230031；2.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601；3.青海省農林科學院，青海 西寧 810016）

藜麥屬于藜科，產自安第斯山脈，有7 000年左右的歷史，是當地的主要食物來源，被稱為糧食之母[1]。藜麥相比其它谷物，營養更加均衡豐富，富含蛋白質、礦物質、脂肪酸和維生素等[2-3]。此外，藜麥還含有黃酮、皂苷和多酚等生物活性物質，具有抗氧化和抗癌等多種藥理作用，被聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO） 認定為一種“全營養食品”[4]。為了在世界上推廣藜麥，聯合國將2013年設定為國際藜麥年，藜麥被越來越多的消費者了解，藜麥的產品也得到越來越多的歡迎和支持。近些年，藜麥在中國的青海、新疆、山西和寧夏開始被種植，藜麥也因此走上了中國人的餐桌。

藜麥蛋白主要分布在藜麥的胚、胚乳以及種皮里，含量為14%左右[5]，并且藜麥蛋白也是一種含有大量賴氨酸和組氨酸的優質蛋白質[6]，高于水稻、大麥和玉米等大多數谷類，和小麥蛋白含量相當[7]，是一種很好的植物蛋白來源。目前科學家對于藜麥的研究主要集中在它的籽實部位，只有少量關于藜麥秸稈的發酵可以改善其作為飼料價值的研究，絕大多數秸稈在收割時會被遺棄。與其他作物的秸稈相比，藜麥秸稈含有豐富的粗蛋白質，含量為10.14%～13.14%[8]，但目前對于藜麥秸稈蛋白的結構與功能性質鮮見報道。因此為了進一步開發藜麥植株潛在的營養和應用價值，本文研究和分析藜麥秸稈蛋白質的結構特性及pH值和溫度對其功能性質的影響，以期望可以開發出具有適當功能特性的植物蛋白，來解決藜麥收割后的秸稈處理問題以及為藜麥秸稈蛋白的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥秸稈（青藜2號）：青海省農科院藜麥種植基地栽培，粒色白色，株高170 cm，2019年4月中下旬以覆膜穴播方式播種，2019年10月收獲，秸稈經晾曬至水分為10%～12%，無腐敗現象；蛋白Maker：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；聚丙烯酰胺、四甲基乙二胺、Tris/HCl緩沖液、過硫酸銨、β-巰基乙醇、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：合肥拜爾迪生物技術有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CT15RT臺式高速冷凍離心機：上海天美科學儀器有限公司；ALPHA1-2LD冷凍干燥機：德國CHRIST公司；IR Prestige型傅里葉紅外光譜儀：日本島津公司；VELP-UDK159全自動凱氏定氮儀：北京金洋萬達科技有限公司；DSC8000差示量熱掃描儀：美國Perkin Elmer公司；DYY-4C型高壓雙穩電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥秸稈蛋白的制備

1.3.1.1 提取流程

參照許新月等[9]的方法提取藜麥秸稈蛋白。提取流程：藜麥秸稈→加入3倍水→打漿1min→超聲30min→過濾→調節pH值至5→加纖維素酶→酶解8 h→滅酶→5 000 r/min離心20 min→真空冷凍干燥→產物干粉。

1.3.1.2 藜麥秸稈蛋白純度的測定

藜麥秸稈蛋白的含量采用凱氏定氮法進行測定，藜麥秸稈蛋白純度按下列公式計算。

式中：P為藜麥秸稈蛋白的純度，%；m為產物干粉中藜麥秸稈蛋白的質量，g；M為產物干粉質量，g。

1.3.2 藜麥秸稈蛋白的結構測定

1.3.2.1 藜麥秸稈蛋白分子量測定

參照張越[10]的方法，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定藜麥秸稈蛋白質分子量。測定條件：配制12%的分離膠、5%的濃縮膠；上樣15 μL；濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓200 V；常溫（25℃左右）固定膠板、染色、脫色。

1.3.2.2 藜麥秸稈蛋白的熱學特性

參照邱月[11]的方法，使用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測定藜麥秸稈蛋白的熱學特性。將2 mg藜麥秸稈蛋白粉在鋁盒中均勻鋪平，密封壓片，放入DSC儀器中進行檢測，對照組為密封的空鋁盒，加熱速率為10℃/min，樣品溫度范圍為30℃～150℃。

1.3.2.3 藜麥秸稈蛋白巰基和二硫鍵含量的測定

參照王洪偉等[12]方法對藜麥秸稈蛋白巰基和二硫鍵含量進行測定。游離巰基含量：向0.5 mL 10 mg/mL藜麥秸稈蛋白樣品中加入0.02 mL 4 mg/mL DTNB和2.5 mL 8 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制），25℃條件下反應25 min后，在412 nm波長下測定其吸光度值。總巰基含量：向0.2 mL 10 mg/mL藜麥秸稈蛋白樣品中加入0.02 mLβ-巰基乙醇和1.0 mL 10 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制），混勻后在25℃條件下反應1 h，然后量取10 mL 12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）加到樣品中，25℃繼續反應1 h后，在5 000 r/min條件下離心10 min，用12%TCA溶液洗滌離心所得沉淀物兩次，然后將洗滌后的沉淀物用3.0 mL 8 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制）溶解，再繼續添加0.04 mL DTNB，25℃條件下反應25 min，最后在412 nm波長下測其吸光度值。空白試驗均用Tris-HCl，平行測定3次。按下列公式進行計算。

式中：1.36×104為 Elman 的摩爾消光系數；A412為412 nm波長處測得的吸光度值；C為藜麥秸稈蛋白樣品的濃度，mg/mL；D 為稀釋因子（D1為6.04、D2為15）。

1.3.2.4 藜麥秸稈蛋白二級結構的測定

參照魏君慧等[13]的方法。稱取1 mg藜麥秸稈蛋白粉，與100 mg KBr粉末混合，壓制成薄片。以KBr為背景，在4 000 cm-1～400 cm-1波數下對藜麥秸稈蛋白進行紅外光譜分析，掃描次數為64次。

1.3.3 藜麥秸稈蛋白功能性測定

1.3.3.1 藜麥秸稈蛋白溶解度

參照Wu等[14]的方法。取20 mL 10.0 mg/mL藜麥秸稈蛋白溶液，在一定溫度和pH值條件下水浴攪拌1 h，離心 10 min（4 000 r/min），測定上清液中蛋白質的含量。考察不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白溶解度的影響：設定溫度為 30、40、50、60、70 ℃；pH 值為 3、5、7、9、11。溶解度按下列公式計算。

1.3.3.2 藜麥秸稈蛋白吸水性

參照張艷榮等[15]的方法。取20 mL 10.0 mg/mL的藜麥秸稈蛋白溶液，在一定溫度和pH值條件下水浴攪拌 1 h，離心 10 min（4 000 r/min），棄去上清液，測量殘留物質的質量。考察不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白吸水性的影響：設定溫度為 30、40、50、60、70 ℃；pH 值為 3、5、7、9、11。吸水性按下列公式計算。

1.3.3.3 藜麥秸稈蛋白起泡性

參照鄭文彬等[16]的方法。取50 mL 10.0 mg/mL的藜麥秸稈蛋白溶液，在一定溫度和pH值條件下高速攪拌20 min，用量筒測量泡沫體積及液體體積。考察不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白的起泡性的影響：設定溫度為 30、40、50、60、70 ℃；pH 值為 3、5、7、9、11。起泡性按下列公式計算。

1.3.4 數據處理

利用Excel和Origin 8.5軟件對試驗過程中測定的數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 藜麥秸稈蛋白的純度

通過凱氏定氮法對提取得到的藜麥秸稈蛋白粉中的蛋白質含量進行測定，得到藜麥秸稈蛋白純度為80.55%，其純度高于王棐等[17]提取的藜麥蛋白純度（78.30%）和Aluko等[18]提取的藜麥蛋白純度（65.52%）。

2.2 藜麥秸稈蛋白結構特性

2.2.1 藜麥秸稈蛋白分子量測定結果

藜麥秸稈蛋白的SDS電泳圖譜見圖1。

圖1 藜麥秸稈蛋白的SDS電泳圖譜Fig.1 SDS electrophoresis pattern of quinoa straw protein

由圖1中可以看出，藜麥秸稈蛋白在66.4 ku～97.2 ku、29.0 ku～44.3 ku、20.1 ku～29.0 ku、14.3 ku～20.1 ku以及小于14.3 ku范圍內有條帶，其29.0 ku～44.3 ku和小于14.3 ku條帶染色程度較深，表明該分子質量范圍內的蛋白含量較高，因此可以說明藜麥秸稈蛋白中中低分子量的蛋白質占多數。

球蛋白和白蛋白是藜麥蛋白的兩種主要蛋白質，它們具有特殊的二級結構，其亞基之間的相互作用影響著蛋白質的結構和理化學性質[19]。11S球蛋白，是許多雙子葉植物家族的主要成分，分子量范圍在20 ku～22 ku和33 ku～36 ku附近[20]，所以圖1中分子量在29.0 ku～44.3 ku和20.1 ku～29.0 ku范圍內的條帶可能為11S球蛋白。2S白蛋白是第二豐富的蛋白質，對應的分子量小于20 ku[21]，圖1中分子量為14.3 ku～20.1 ku和小于14.3 ku范圍內的條帶可能為2S白蛋白。

2.2.2 藜麥秸稈蛋白熱學特性結果分析

藜麥秸稈蛋白的DSC曲線見圖2。

圖2 藜麥秸稈蛋白的DSC曲線Fig.2 DSC curve of quinoa straw protein

在DSC曲線上若有吸熱峰，則該吸收峰區域為變性溫度范圍，吸收峰的峰值所對應的溫度是該樣品的熱變性溫度[22]。由圖2可以看出，藜麥秸稈蛋白出現了一次吸收峰，說明發生了一次變性。藜麥秸稈蛋白的變性溫度較高，起始變性溫度為131.06℃，峰值變性溫度為132.72℃，終止變性溫度為134.51℃。變性熱焓的大小還可以作為蛋白變性程度的依據，熱焓越大，表明變性越小[23-24]，藜麥秸稈蛋白的焓變為7.82 J/g，而Abugoch等[25]研究發現藜麥蛋白的變性熱焓為12.40 J/g，變性溫度為98.1℃，可以看出藜麥秸稈蛋白的熱穩定性更好，變性程度更大。

2.2.3 藜麥秸稈蛋白巰基和二硫鍵含量的分析

二硫鍵通常能與同樣具有很高化學活性的巰基之間發生相互轉化，從而共同影響著蛋白質結構的穩定及其功能性質。所以，測定蛋白質中的巰基和二硫鍵含量，在分析研究蛋白質分子的空間結構和功能性質之間的關系尤為重要[26]。藜麥秸稈蛋白的巰基鍵和二硫鍵含量見圖3。

圖3 藜麥秸稈蛋白的巰基鍵和二硫鍵含量Fig.3 The sulfhydryl bond and disulfide bond content of quinoa straw protein

從圖3可以看出，藜麥秸稈蛋白中游離巰基含量為 10.21 μmol/g，二硫鍵含量為 23.57 μmol/g。與一般植物蛋白相比，例如杏鮑菇分離蛋白的游離巰基和二硫鍵含量分別為 40.75 μmol/g 和 10.39 μmol/g[13]，核桃蛋白游離巰基和二硫鍵含量分別為8.45 μmol/g和5.20 μmol/g[27]，藜麥秸稈蛋白的二硫鍵含量更高。在蛋白質分子中，二硫鍵含量影響著蛋白質的空間結構及功能性質，二硫鍵含量高的蛋白質更有利于形成網絡結構[28]。Kinsella[29]研究發現含有二硫鍵的蛋白具有較高的熱穩定性，這也是藜麥秸稈蛋白的熱焓和變性溫度較高的原因。

2.2.4 藜麥秸稈蛋白傅里葉紅外結果分析

一般情況下，蛋白質和多肽在紅外區都有著若干特征吸收譜帶，如酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ帶（1 550 cm-1～1 530 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 300 cm-1～1 260 cm-1）[30]。其中，酰胺I帶最常用于蛋白質二級結構的分析，反映α-螺旋（1 660 cm-1～1 650 cm-1）、β-折疊（1 640 cm-1～1 600 cm-1）、β-轉角（1 700 cm-1～1 660 cm-1）及無規則卷曲（1650cm-1～1640cm-1）等不同結構信息[31]。通過對藜麥秸稈蛋白酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）的圖譜去卷積、基線校準、二階導數擬合后進行分峰擬合得到圖4。

圖4 藜麥秸稈蛋白在酰胺I帶的分峰擬合圖Fig.4 Peak fitting diagram of quinoa straw protein in the amide I band

由圖4可知，分峰擬合后共獲得8個單一峰，計算各子峰的面積，得出相對應結構所占比例，結果如表1所示。

表1 藜麥秸稈蛋白的二級結構的含量Table 1 The content of secondary structure of quinoa straw protein

由表1可知，藜麥秸稈蛋白的二級結構以β-轉角為主，含量為36.42%，β-轉角可以促進蛋白質生成球狀結構；α-螺旋和β-折疊含量相當，分別為25.19%和25.91%，β-折疊含量高也可以進一步說明藜麥秸稈蛋白的變性溫度較高；而無規則卷曲含量最低，為12.48%。因為β-轉角在藜麥秸稈蛋白二級結構中含量最高，所以藜麥秸稈蛋白的功能性質很可能大部分取決于β-轉角，其它的二級結構也同樣影響著其功能性質。

2.3 藜麥秸稈蛋白的功能性質

2.3.1 藜麥秸稈蛋白的溶解度

蛋白質的溶解度可以作為評價食品品質和穩定性的主要指標之一，它對蛋白的吸水性、起泡性等都會產生一定的影響。不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白溶解度的影響見圖5。

圖5 不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of different temperatures and pH on the protein solubility of quinoa straw

從圖5a可以看出，蛋白質的溶解度在30℃～60℃不斷上升，當溫度達到60℃時，溶解度達到最高，為53.61%，但是隨著溫度繼續升高，蛋白質溶解度在不斷減小。這是因為適宜的溫度可以促進蛋白質的溶解，然而當溫度過高時，會導致蛋白質發生變性，進而導致溶解度的降低[32]。從圖5b可以看出，當pH值在3～5時，溶解度不斷減小，因為pH值接近等電點時，溶解度最小。當pH值大于5時，溶解度不斷增加，在pH值為9時，蛋白質溶解度達到最大，為46.37%。這是因為在堿性pH值條件下，氨基的脫質子和羧基的電離導致帶負電荷的物質變多，蛋白質與溶劑的相互作用得到改善，使蛋白質的溶解度增加，但是隨著堿性繼續增強，導致蛋白質變性，溶解度下降[33]。因此，藜麥秸稈蛋白更適合在中性或弱堿性的條件下使用。藜麥蛋白最高溶解度為63.68%，藜麥秸稈蛋白的最高溶解度比藜麥蛋白低，但是在pH值為3時，藜麥秸稈蛋白的溶解度（36.35%）比王棐等[17]研究的藜麥蛋白的溶解度（約20%）、大豆蛋白溶解度（約10%）和豌豆蛋白溶解度（約5%）都高，這也為藜麥秸稈蛋白其它的功能性質研究提供基礎。

2.3.2 藜麥秸稈蛋白的吸水性

蛋白質的吸水性表示蛋白質結合水分子的能力，是蛋白質的重要功能性質，對于研究食品的質地、水分含量以及口感有重要作用。不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白吸水性的影響見圖6。

圖6 不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白吸水性的影響Fig.6 Effect of different temperatures and pH values on the water absorption of quinoa straw protein

由圖6a可知，溫度在30℃～60℃時，藜麥秸稈蛋白的吸水性呈上升趨勢，在60℃吸水性達到最大，為3.11 g/g，隨著溫度的進一步升高，吸水性降低。這是因為溫度低于變性溫度時，蛋白質會發生伸展，有一部分親水基團可能會和水結合，然而溫度過高，蛋白變性，暴露許多非極性基團，減弱了與水的作用，導致吸水性降低[15]。由圖6b可以看出，蛋白質的吸水性隨著pH值的升高呈先降低后增加再降低的趨勢，在pH值為9的時候，蛋白吸水性最高為3.34 g/g。這是因為pH值接近蛋白質等電點，蛋白質-水分子間結合的能力最弱，隨著pH值的升高，偏離等電點，蛋白質的吸水能力隨之增強[34]。但是堿性繼續增強，蛋白會發生變性，所以吸水性變弱，該現象進一步說明了pH值對蛋白的吸水性有較大影響。另外，藜麥秸稈蛋白的吸水性比何興芬[35]研究的藜麥蛋白最大持水性1.62 g/g要高，所以藜麥秸稈蛋白在食品品質研究上具有重要價值。

2.3.3 藜麥秸稈蛋白的起泡性

不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白起泡性的影響見圖7。

圖7 不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白起泡性的影響Fig.7 Effect of different temperatures and pH values on the foaming ability of quinoa straw protein

由圖7a可以看出，蛋白質的起泡性隨著溫度的升高呈上升趨勢，在60℃條件下，蛋白起泡性最高為40.24%。這是因為溫度適當地提高，可以增大蛋白的溶解度，使可溶性蛋白含量增加。又由于泡沫的形成與可溶性蛋白含量有關，所以促進了起泡性的增加[36]。但是隨溫度繼續升高，蛋白發生變性，進而起泡性降低。由圖7b可以看出，藜麥秸稈蛋白質的起泡性在pH值為9時最高（40.86%）；pH值為5時最低（26.36%）。這是因為pH值為5時，溶解度較低，可溶性蛋白含量少，形成泡沫較少[36-37]。隨著溶液pH值呈堿性，藜麥秸稈蛋白里的凈電荷在不斷增加，疏水作用力減小，蛋白質擴散到溶液界面的速度加快，產生大量泡沫[38]，所以藜麥秸稈蛋白起泡性增加。

3 結論

本文研究了藜麥秸稈蛋白的結構特性和功能性質，發現藜麥秸稈蛋白以中低分子量的蛋白居多，分子量主要分布在29.0 ku～44.3 ku和小于14.3 ku的范圍內。藜麥秸稈蛋白變性溫度為132.72℃，有著較好的熱穩定性，其巰基和二硫鍵含量較高，這也是藜麥秸稈蛋白熱焓和變性溫度較高的一個原因。紅外光譜分析藜麥秸稈蛋白的β-轉角相對占比最高，α-螺旋和β-折疊相當，無規則卷曲占比最低。另外，溫度為60℃時和pH值為9時，藜麥秸稈蛋白的溶解度、吸水性和起泡性最好，說明溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白的溶解度、吸水性和起泡性等功能性質影響較大，因此研究蛋白性質時要注意控制這些影響因素。本研究為藜麥秸稈蛋白的產品研究和開發提供參考。