利用不同啟動子調控啤酒酵母產醇酯比的研究

崔丹瑤，慕濟鍺，張卜升，郭立蕓，謝鑫，劉小二，林良才，張翠英*

（1.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京 101300）

啤酒是世界上最受消費者歡迎的酒精飲料之一。水、麥芽、谷物、啤酒花和酵母菌是釀造啤酒的主要原料，在釀造過程中，谷物中的可利用糖類被酵母菌轉化成乙醇、二氧化碳，同時生成復雜的風味物質[1]。啤酒中的風味物質含量雖然相對較低，但種類豐富，目前已檢測出了約1 000種[2]。普遍認為高級醇和酯類物質是啤酒中的主要風味物質，對啤酒的香氣與品質具有重要的影響[3-5]。高級醇使啤酒的酒體更加醇厚、豐滿，提高酒的品質；酯類物質賦予了啤酒特殊的芳香氣味，有助于提高酒的香氣[6]。相關研究表明，啤酒中高級醇與酯類含量比例在3∶1～4∶1之間較為適宜[7]。醇酯比過高或過低均會引起風味失調，繼而對啤酒的品質產生負面影響[8]。

為了提高啤酒的口感與品質，許多學者通過改變啤酒發酵的工藝參數來調整高級醇與酯類物質的生成量和比例。劉連成[9]和劉明麗等[10]的研究均證明了提高啤酒酵母的接種量會降低高級醇生成量，從而間接降低啤酒的醇酯比。鐘成等[11]利用濃度為11°P和14°P的麥汁分別進行啤酒發酵，發現麥汁濃度的提升有助于乙酸乙酯含量的提高。Sun等[12]將啤酒的發酵溫度由10℃提升至25℃后，正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量明顯提高，同時發酵周期從192h縮短為72h。

除改變工藝參數外，劉玉蘭等[13]選育出一株過表達醇乙酰基轉移酶編碼基因ATF1，同時缺失支鏈氨基酸轉氨酶編碼基因BAT2的啤酒酵母菌株，其總酯生成量較出發菌株提高了7.9倍。然而，突變株釀造的啤酒醇酯比僅為0.9∶1，這帶來了醇酯比失調的隱患。為了更好地調控啤酒醇酯比，本研究利用3種不同的啟動子（TEF1p、VPS8p、ATF1p）分別構建過表達 ATF1基因的啤酒酵母突變株。對3株突變株的生長性能和發酵性能進行全面評估，通過啤酒發酵試驗，探究不同啟動子對啤酒醇酯比的調控效果，為啤酒酵母工程菌株的選育與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

下面發酵酵母（Saccharomyces pastorianus）S5、大腸桿菌Escherichia coli DH5α、質粒：天津市工業微生物重點實驗室保存。本研究涉及到的菌株與質粒信息見表1。

表1 本研究中的菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids in this study

1.1.2 引物

本研究中的引物均列于表2。引物由Primer 5.0軟件進行設計，引物中的酶切位點以下劃線標注。

表2 本研究涉及的引物Table 2 Primers used in this study

續表2 本研究涉及的引物Continue table 2 Primers used in this study

1.1.3 主要培養基

LB培養基：氯化鈉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，121℃滅菌15 min。

YEPD培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，121℃滅菌15 min。篩選酵母重組菌株時，在YEPD培養基中添加硫酸鹽遺傳霉素溶液（G418）至400 μg/mL。

麥芽汁培養基：稱取500 g粉碎后的麥芽，加入2 000 mL蒸餾水，料水比為 1∶4（g/mL），65℃糖化 2 h后過濾并離心，用糖度計調至12°Brix，115℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.4 試劑與儀器

限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、Primer STAR DNA聚合酶、連接酶：TaKaRa（大連）公司；質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒：Omega Bio-Tek（美國）公司；乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇標準品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TgL-16C高速離心機：上海安亭科技儀器廠；Bioscreen C全自動生長曲線分析儀：芬蘭OY GrowthCurves公司；7890A型氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；TD32糖度計：上海力辰邦西儀器科技有限公司；ZXJD-A1270恒溫培養箱：上海智城分析儀制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒載體的構建

以啤酒酵母菌株S5基因組為模板，使用引物TEF1-F/TEF1-R、VP-F/VP-R和AP-F/AP-R進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），分別得到啟動子片段TEF1p、VPS8p、ATF1p。以質粒pUC-PABBK和pUG6為模板，經PCR擴增后分別得到片段ATF1-PGK1t和KanMX。將啟動子TEF1p和VPS8p分別與片段ATF1-PGK1t進行融合，構建片段TEF1p-ATF1-PGK1t和 VPS8p-ATF1-PGK1t。

利用限制性內切酶BamH I和Sma I對片段TEF1p-ATF1-PGK1t和 VPS8p-ATF1-PGK1t進行酶切處理，與經相同酶切處理的質粒pUC-BB進行連接，分別構建重組質粒pUC-BBTP和pUC-BBVP。最后這兩個質粒經內切酶Kpn I線性化后分別與片段KanMX相連接，PCR驗證后即獲得了重組質粒pUCBBTPK與pUC-BBVPK。

利用限制性內切酶Sma I對片段ATF1-PGK1t和質粒pUC-BB進行酶切并連接，獲得質粒pUC-BBAP。用Pst I對片段ATF1p進行單酶切后，與線性化質粒pUC-BBAP連接，構建重組質粒pUC-BBAAP。最后，經Kpn I酶切后的質粒pUC-BBAAP與經相同處理的片段KanMX連接，PCR驗證后即獲得了重組質粒pUC-BAAPK。

1.2.2 啤酒酵母菌株的轉化

分別以質粒pUC-BBTPK、pUC-BBVPK和pUCBAAPK為模板，BQ-F/BQ-R為引物，經PCR擴增獲得表達盒BA-TEF1p-ATF1-PGK1t-loxP-KanMX-loxPBB（5 219 bp）、BA-VPS8p-ATF1-PGK1t-loxP-KanMX-loxP-BB（5 251 bp）、BA-loxP-KanMX-loxP-ATF1p-ATF1-PGK1t-BB（5 502 bp）。利用醋酸鋰轉化法將目的片段轉化至啤酒酵母中，經稀釋后涂布于含有G418抗性（400μg/mL）的YEPD平板上，30℃靜置培養48h[14]。培養結束后，對轉化子進行PCR驗證，正確的轉化子經純化后保存于YEPD固體斜面中。根據重組菌株中啟動子元件的不同，將菌株分別命名為S5-T（TEF1p）、S5-V（VPS8p）、S5-A（ATF1p）。

1.2.3 啤酒發酵

首先取斜面菌種一環，接種于含有5 mL麥汁培養基的試管中，于30℃培養箱中靜置培養24 h。隨后將5 mL培養液傾倒至含有45 mL麥汁培養基的錐形瓶（150 mL規格）中，16℃靜置培養36 h。最后按10%接種量（體積比）將二級種子液接入含有135 mL麥汁的250 mL三角瓶內，10℃靜置發酵7 d。發酵期間每12 h稱重一次，當CO2失重量小于0.1 g時視為發酵終止。發酵結束后對發酵液進行蒸餾，檢測餾出酒樣的酒精度及風味物質含量。

1.2.4 基本發酵性能分析

采用稱重法測定CO2釋放量；采用斐林試劑法[15]測定發酵液中剩余還原糖含量；采用密度瓶法測定酒樣中的酒精度；采用次甲基藍染色法檢測酵母死亡率。

1.2.5 風味物質含量檢測

主要風味物質含量通過氣相色譜進行檢測[16]。氣相色譜儀的色譜柱采用Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），載氣為高純氮氣，柱流速為0.8 mL/min，進樣口溫度200℃，檢測器溫度150℃。升溫程序：起始溫度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150℃，保持15 min；分流進樣，分流比為10∶1。

1.2.6 生長曲線的檢測

利用全自動生長曲線分析儀檢測出發菌株與重組菌株的生長曲線，具體操作參考葛峻伶等[17]的方法。

1.2.7 數據分析

每組試驗均設置3組平行，數據以平均值±標準誤差的形式表示。使用Student’s t-test檢驗分析重組菌株和出發菌株之間的差異，P＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 重組菌株的獲得

重組表達盒中包含BAT2基因的上游同源臂BA與下游同源臂BB，通過酵母同源重組機制，重組表達盒能夠整合至BAT2基因位點處，實現對BAT2基因的敲除和ATF1基因的過表達。根據敲除BAT2后的酵母基因組序列，設計上下游引物，以陽性轉化子與出發菌株S5的基因組為模板進行PCR驗證，驗證結果如圖1所示。

圖1 重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的PCR驗證Fig.1 The PCR verification of recombinant strains S5-T，S5-V，S5-A

由圖1可知，以重組菌株S5-T、S5-V、S5-A基因組為模板時，能夠擴增出單一明亮的條帶，且長度與預期一致；以出發菌株S5基因組為模板則無法擴增出條帶。驗證結果證明了重組盒已經成功替代了BAT2基因，實現了BAT2基因的敲除與ATF1基因的過表達。

2.2 重組菌株生長性能的比較

為了確定不同啟動子過表達ATF1基因對菌株的生長性能是否存在影響，檢測了出發菌株S5及重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的生長曲線，結果如圖2所示。

圖2 出發菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的生長曲線Fig.2 Growth curve of parental strain S5 and recombinant strain S5-T、S5-V、S5-A

由圖2可知，在0～1 h時，酵母處于停滯期，生長速度較緩慢；2 h～10 h處于對數生長期，酵母大量增殖，菌體濃度明顯增加；10 h后，酵母處于穩定期，酵母數量基本保持不變。3株重組菌株與出發菌株S5的生長曲線無明顯差異，這證明不同啟動子對ATF1基因的過表達和BAT2基因的敲除對菌株的生長性能沒有造成負面影響。

2.3 重組菌株基本發酵性能的比較

出發菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A發酵性能分析見表3，啤酒酵母菌株的CO2釋放量曲線見圖3。

表3 出發菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A發酵性能分析Table 3 The fermentation performances of strains S5，S5-T，S5-V，S5-A

圖3 啤酒酵母菌株的CO2釋放量曲線Fig.3 The CO2weight loss curve of brewer's yeast strain

在啤酒發酵過程中，剩余還原糖含量、細胞死亡率與發酵度是衡量酵母菌株基本發酵性能的幾種常規指標。由表3可知，出發菌株S5發酵液的剩余還原糖含量為1.40 g/100 mL，死亡率為1.23%，外觀發酵度與真正發酵度分別為71.32%和61.53%。與出發菌株相比，重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的基本發酵性能均未見明顯差異。此外，通過發酵期間CO2的釋放量來檢測啤酒酵母菌株的發酵速率。由圖3可知，出發菌株S5與重組菌株S5-T、S5-V、S5-A的CO2釋放量趨勢基本一致，發酵周期為7 d，總失重均為4.9 g。這些結果表明，利用啟動子TEF1p、VPS8p、ATF1p過表達ATF1基因不會影響啤酒酵母菌株的基本發酵性能。

2.4 產酒精能力的測定

啤酒酵母菌株生成酒精的能力對啤酒的發酵有著重要的影響，采用密度瓶法檢測酒樣中的酒精度，結果見表4。

表4 出發菌株與重組菌株的乙醇含量Table 4 The ethanol contents produced by parental strain and recombinant strains

由表4可知，菌株S5-T、S5-V和S5-A的酒精度分別為 3.75%vol、3.79%vol和 3.76%vol，與出發菌株S5的酒精度（3.8%vol）相比無明顯差別。在啤酒酵母的酯類物質代謝中，雖然部分乙醇在醇乙酰基轉移酶的催化下會被轉化為乙酸乙酯，但研究結果證明過表達ATF1基因不會對菌株的產酒精能力造成負面影響。在Zhang等[18]的研究中，利用磷酸甘油酸激酶基因啟動子PGK1p過表達ATF1基因的菌株，其乙醇生成能力同樣未受到影響，這支持了本文的研究結果。

2.5 風味物質含量的測定

酵母菌株S5、S5-T、S5-V、S5-A經過麥芽汁啤酒發酵后，利用氣相色譜檢測了主要風味物質含量，結果見圖4。

圖4 菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的風味物質生成量Fig.4 The concentration of flavor substance produced by strain S5，S5-T，S5-V and S5-A

由圖4可知，菌株S5-T、S5-V、S5-A的乙酸乙酯生成量較出發菌株S5分別提高了2.56倍、1.21倍和1.24倍。高級醇類物質中，異丁醇與異戊醇的含量出現了較為明顯的變化。與出發菌株S5相比，菌株S5-T、S5-V、S5-A的異丁醇生成量分別降低了12.17%、17.93%、16.85%；異戊醇生成量分別降低了10.2%、5.79%、8.21%；正丙醇含量沒有明顯變化。

結果表明，利用啟動子TEF1p、VPS8p、ATF1p對ATF1基因進行過表達能夠小幅度調控乙酸乙酯的生成量。在前期的研究中，發現過表達ATF1基因會提高醇乙酰基轉移酶的酶活力，這是乙酸乙酯含量提高的主要原因[19-21]。Fischer等[22]利用啟動子UBI4p過表達ATF1基因，冷激條件下乙酸乙酯含量較親本菌株增加1.3倍，這與本文的研究結果相似。另外，BAT2基因的缺失導致了支鏈氨基酸轉氨酶的酶活力降低，阻礙了纈氨酸、亮氨酸轉化為α-酮異戊酸和α-酮異己酸，這兩種α-酮酸合成受阻使異丁醇和異戊醇的生成量降低[23-24]。

2.6 重組菌株醇酯比的比較

乙酸乙酯是啤酒中含量最高的酯類物質，因此用乙酸乙酯含量來代表總酯含量[3]。菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的醇酯比見圖5。

圖5 菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的醇酯比Fig.5 Ratio of higher alcohols to esters in strains S5，S5-T，S5-V and S5-A

由圖5可知，出發菌株S5的醇酯比為8.1∶1，遠高于拉格啤酒的最適醇酯比[7]。由于菌株S5-T、S5-V、S5-A的總高級醇生成量下降，總酯生成量提高，因此醇酯比發生了變化。當VPS8p和ATF1p調控ATF1基因時，菌株S5-V和S5-A的醇酯比略有下降，分別為6.2∶1和5.9∶1。菌株S5-T的醇酯比為2.9∶1，最接近最適醇酯比。結果證明利用TEF1p、VPS8p和ATF1p對ATF1基因進行過表達能夠有效地調控總高級醇和總酯的含量，優化醇酯比，從而達到提高啤酒品質的目的。

3 結論

以啤酒酵母S5為出發菌株，利用啟動子TEF1p、VPS8p和ATF1p分別過表達ATF1基因，選育出重組菌株S5-T、S5-V和S5-A。通過啤酒發酵試驗，探究了不同啟動子元件對啤酒醇酯比的調控效果和影響。結果顯示，菌株S5-V和S5-A的醇酯比偏高，分別為6.2∶1和5.9∶1，這可能是由于VSP8p和ATF1p的啟動子強度較低，導致乙酸乙酯含量提升幅度較低；菌株S5-T的醇酯比為2.9∶1，接近啤酒的醇酯比要求，具有一定的工業應用潛力。后續研究可以采用啟動子工程，對啟動子元件進行改造，進一步選育符合啤酒醇酯比要求的啤酒酵母菌株。本研究證實了利用不同啟動子元件調控啤酒醇酯比的可行性，為選育具有優良工業啤酒酵母菌種提供了新的改造策略和參考。