百里香酚微膠囊的反溶劑法制備工藝

李曉宇，李瑞紅，張悅，郭鵬，董爽

(山東理工大學 農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049)

百里香酚(5-甲基-2-異丙基酚，thymol)又稱麝香草酚，是一類從百里香中分離得到的芳香族化合物。百里香酚具有殺菌抑菌，防腐，抗酸敗等作用[1-2]，已經被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準為食品添加劑。百里香酚添加到食品之中以后可以起到增香、除臭、防腐等方面的作用[3]；其次，百里香酚的次生代謝產物是黃酮類化合物[4]，可以通過清除DPPH等自由基以及一些超氧化物，減少脂質過氧化物的產生來達到抗氧化的目的，是一種天然的抗氧化劑[5-6]；但是，百里香酚在水中的溶解度很低，限制其在食品水相中的應用[7]，且易揮發，生物利用度比較低[8-9]；因此，提出通過大分子物質將其進行包埋，提高其在水相體系中溶解度以及生物利用度。

玉米醇溶蛋白(zein)是玉米精深加工所產生的副產物中提取的一種醇溶蛋白，其疏水性氨基酸含量比較高[10]，具有兩親性，并且有獨特的自組裝特性[11]，玉米醇溶蛋白的這種性質適合于作為壁材對活性物質進行包埋。近些年對玉米醇溶蛋白獨特性質的研究逐漸增多[12-14]，研究表明，用其對活性物質進行包埋，一方面可以保持包埋物質的生物活性，另一方面可以提高其溶解性以及生物利用度[15-16]。

本研究主要是基于玉米醇溶蛋白的自組裝功能，采用反溶劑的方法對百里香酚進行包埋。以包封率為指標選取芯壁比、混合溶液與去離子水混合溶液體積比、混合溶液向去離子水滴加速率三個因素進行單因素試驗，在單因素的基礎上進行三因素三水平響應面優化試驗，確定最佳制備工藝，并對最佳條件制備的微膠囊進行表征。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

玉米醇溶蛋白(純度92.8%)，江蘇高郵日星藥用輔料有限公司；百里香酚，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HL-2型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；FD-1D型冷凍干燥機：北京博醫康試驗儀器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀：英國馬爾文儀器有限公司；Nicolet5700型傅里葉變換紅外光譜儀：美國Thermo Electron公司；D8-02型X-射線衍射儀：德國Brucker AXS公司；Q2000型差示掃描量熱儀：美國TA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊的制備

根據Yang等[17]方法稍做修改，采用反溶劑法制備玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊，將1 g玉米醇溶蛋白溶解于50 mL 80%無水乙醇，配成玉米醇溶蛋白溶液。稱取不同質量的百里香酚加入到玉米醇溶蛋白溶液中，配制成不同芯壁比的混合溶液，磁力攪拌30 min，按照一定的流速緩慢注入去離子水中，并磁力攪拌30 min使其混合均勻。將制備的膠體溶液在40 ℃下真空旋蒸15 min，隨后在3000 r/min下離心5 min得到上清液，即制得所需的復合粒子膠體溶液，膠體溶液進行冷凍干燥48 h，得到分散的玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊顆粒(ZT)。

1.3.2 包封率的測定

將梯度濃度的百里香酚制成標準液，在最大吸收波長283 nm處測量其吸光度，以百里香酚濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

稱取10 mg的凍干復合顆粒于試管中，加入10 mL無水乙醇輕輕震蕩1 min后靜置30 min。取上清液在百里香酚最大波長283 nm處測量吸光度，根據標準曲線標曲計算百里香酚含量，記為W1。

稱取10 mg的凍干復合顆粒于試管中，加入10 mL無水乙醇，在室溫下超聲30 min以充分提取百里香酚。將提取液在3 000 r/min下離心10 min，取上清液在百里香酚最大波長283 nm處測量吸光度，根據標準曲線計算百里香酚含量，記為W2。百里香酚復合顆粒的包封率按照如下公式計算[18]：

(1)

式中：W1為游離的百里香酚的含量，μg；W2為總的百里香酚的含量，μg。

1.4 單因素及響應面優化

以芯壁比(百里香酚：玉米醇溶蛋白=1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，溶劑反溶劑體積比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)，溶劑反溶劑滴加速率(0.2、0.7、1.2、1.7、2.2 mL/min)，包封率為指標進行單因素實驗。在單因素試驗的基礎上以包封率(%)為優化指標，以芯壁比(X1)、溶劑反溶劑體積比(X2)、溶劑反溶劑混流速 (X3)為試驗因素，進行三因素三水平的響應面優化試驗，對ZT微膠囊粒子的制備條件進行優化,因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Tab.1 Response surface test factor level table

1.5 理化特性及結構表征

1.5.1 粒徑

使用激光粒度儀可以測定每份樣品的粒徑分布和粒徑大小。使用1 000 mL燒杯加入600 mL去離子水，調節粒度儀轉速為2 000 d/min，測定背景，背景測定完成后向燒杯中加入一定濃度的ZT膠體溶液，等遮光度達到80%以上開始測定。

1.5.2 熱力學特性

稱取5 mg凍干后的樣品放入鋁盤里，加蓋后壓緊，置于差示掃描量熱儀中，以空白鋁盒為對照。溫度掃描范圍20～200 ℃，掃描速率10 ℃/min。

1.5.3 傅里葉紅外光譜

將干燥的微膠囊顆粒研磨后與KBr按照一定的比例混合，研磨均勻，經壓片后對樣品進行傅里葉紅外光譜分析。掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數32次。

1.5.4 X-射線衍射光譜

采用X-射線衍射儀對凍干的樣品進行掃描，X-射線發射器電壓為40 kV，電流為40 mA，采用Cu靶，掃描范圍2θ為3°～70°，掃描速率為2°/min。得到的數據繪制XRD圖譜。

1.5.5 ZT樣品抗氧化性分析

DPPH溶液的配置：稱取5 mg DPPH溶于95%的乙醇溶液中，超聲使其溶解并定容到100 mL，避光冷藏。

樣品溶液的配置：將ZT樣品溶于95%的乙醇配成1mg/mL的溶液。

自由基清除率的測定：加入DPPH測試液2 mL于10mL具塞試管中，分別加入ZT樣液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，再加入95%的乙醇溶液，使具塞試管中溶液的總體積為6 mL，混合搖勻，避光反應30 min，然后測其在517 nm 處的吸光度A1，以不加樣品液為空白組，其吸光度為A0。

(2)

式中：A0為空白樣品的吸光度；A1為ZT樣品溶液的吸光度。

1.6 數據統計與分析

所有實驗重復3次，利用 Design-Expert 軟件進行響應面試驗的設計與分析，采用SPSS進行單因素方差分析，通過Duncan′s多重比較檢驗(P<0.05)進行顯著性分析，所有數據均用平均值±標準偏差的形式表示，并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 芯壁比對包封率的影響

由1.2.2測定的百里香酚的標準曲線方程為：Y=0.005 5X+0.076 5，R2=0.998 9，n=6。在溶劑反溶劑體積比為1∶4，溶劑反溶劑滴加速率為1.2 mL/min，百里香酚與玉米醇溶蛋白的質量比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的條件下，玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊的包封率如圖1所示。

圖1 芯壁比對包封率的影響Fig.1 Effect of core-wall ratio on encapsulation efficiency

由圖1可知，隨著芯壁比的減小，玉米醇溶蛋白對百里香酚的包封率逐漸增大，當芯壁比為1∶20時包封率達到最大為52.56%±3.75%，隨著芯壁比的進一步減小，包封率開始逐漸下降。其原因是在芯壁比較大的制備條件下，百里香酚的質量過大，百里香酚與玉米醇溶蛋白的結合過飽和，大量的百里香酚游離，致使包封率不高。隨著玉米醇溶蛋白比例的增加，百里香酚與玉米醇溶蛋白的結合位點增多，包封率隨之上升。當到達最佳芯壁比后，芯壁比繼續減少，就會由于芯材百里香酚含量不足，而致使包封率的降低，這與李曉輝等[19]的研究結果一致，因此選擇芯壁比為1∶20。

2.1.2 溶劑反溶劑混合體積比對包封率的影響

在芯壁比1∶15，溶劑反溶劑滴加速率為1.2 mL/min，溶劑反溶劑混合體積比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的條件下，對包封率的影響如圖2所示。

圖2 溶劑反溶劑混合體積比對包封率的影響Fig.2 Effect of mixing volume ratio of solvent and anti-solvent on encapsulation efficiency

由圖2可知隨著溶劑反溶劑的混合體積比的減少，ZT微膠囊的包封率逐漸上升，在溶劑反溶劑體積比為1∶5時，包封率達到最大，這主要是由于反溶劑蒸餾水的體積較少時，混合溶液溶度過高，玉米醇溶蛋白分子之間會通過相互作用發生沉淀聚集而析出，壁材含量下降，導致包封率降低；而隨著體積比的進一步減小，反溶劑體積過多，混合溶液滴加到反溶劑中被稀釋，玉米醇溶蛋白和百里香酚的粒子碰撞減少，導致包封不足，包封率降低，綜上溶劑反溶劑體積比應選擇1∶5。

2.1.3 溶劑反溶劑滴加速率對包封率的影響

在芯壁比為1∶15，溶劑反溶劑體積比為1∶4，溶劑反溶劑混合流速為0.2、0.7、1.2、1.7、2.2 mL/min的條件下，玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊包封率的變化如圖3所示。

圖3 溶劑反溶劑混合流速對包封率的影響Fig.3 Effect of mixed solvent flow rate on entrapment efficiency

由圖3可知，隨著溶劑反溶劑的滴加速率增加，ZT微膠囊的包封率逐漸提高，在流速為1.2 mL/min時達到最大為37.20%±3.39%，主要是由于滴加速率過慢，玉米醇溶蛋白粒子之間通過疏水相互作用相互吸引，聚集形成大顆粒以及絮凝物[20]。隨著滴加速率的增加，粒子的流動速度增加，并且隨著攪拌方向做有規律的離心運動，減少玉米醇溶蛋白粒子發生碰撞的機會，抑制了玉米醇溶蛋白聚集體的形成，從而使得包封率有所提高[21]，因此溶劑反溶劑的滴加速率應為1.2 mL/min。

2.2 響應面實驗結果與分析

根據單因素的實驗結果進行響應面優化試驗，設計方案及結果見表2。以芯壁比、溶劑反溶劑混合體積比、溶劑反溶劑滴加速率(mL/min)為響應變量，以包封率為響應值對表2進行方差分析、模型顯著性分析以及數據結果見表3。

表2 響應面實驗方案及結果Tab.2 Response surface experiment scheme and results

將響應面的實驗結果用Design-Expert數理統計軟件進行回歸擬合，得到響應值Y和各個因子之間的二次多元回歸方程模型為：Y=72.26+3.66X1-2.22X2+4.60X1X2-5.69X12-9.63X22-9.10X32，并對此模型進行方差分析，模型顯著性分析，結果見表3。

由表3的方差分析可知，該模型顯著性檢驗P<0.000 1，模型極顯著，失擬項P>0.05不顯著，表明該模型具有統計學意義。該模型的R2值為0.986 8，變異系數=3.71%，表示98.68%的數據符合擬合模型，該模型的擬合程度良好且誤差較小。一次項X1，X2、交互項X1X2以及二次項X12，X22，X32對包封率的影響均為極顯著(P<0.01)。此外，各因素對包封率影響的排序為X1(芯壁比)>X2(溶劑與反溶劑體積比)>X3(反溶劑流速)。

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 Variance analysis table of regression model

響應面優化實驗模型得出的最優試驗條件為芯壁比為1∶21.52，溶劑反溶劑混合體積比為1∶4.98，溶劑反溶劑滴加速率為1.18 mL/min。考慮到實際操作的可行性，將最優條件調整為芯壁比1∶21.5，溶劑反溶劑混合體積比1∶5，溶劑反溶劑滴加速率1.2 mL/min，進行驗證試驗，試驗重復三次。在最優條件下包封率達到54.04%±2.27%，基本符合預測值，說明模型擬合程度良好，優化實驗正確有效。

2.3 粒徑分析

圖4顯示了玉米醇溶蛋白(a)以及最優條件下制備的ZT復合微粒(b)的粒徑分布圖。基本都是成雙峰分布體積四次矩平均徑D(4,3)是4.863 μm，表面積體積平均徑D(3,2)為0.182 μm，ZT膠體顆粒的粒徑分布呈三峰分布，D(4,3)是1.087 μm，D(3,2)為0.112 μm。與單一的玉米醇溶蛋白相比，ZT復合粒子的曲線呈現出更寬更低的形態，原因可能是百里香酚與玉米醇溶蛋白進行結合，導致粒子的粒徑增大，但是復合顆粒不穩定，因此形成的峰較低

(a)玉米醇溶蛋白

2.4 DSC

通過DSC表征復合微膠囊的熱力學性質，如圖5所示，百里香酚在50.43 ℃出現一個尖銳的吸熱峰，主要是由于百里香酚晶體熔化所形成的。在ZT復合微膠囊的圖譜中并沒有出現此吸熱峰，表明在形成微膠囊的過程中百里香酚原有的晶體結構消失，以無定型的狀態存在于微膠囊中，同時抑制了百里香酚在復合粒子中的結晶，也有可能是百里香酚顆粒基質與玉米醇溶蛋白粒子形成了無定型復合物[22]；同時，ZT復合顆粒的吸熱峰溫度為84.08℃，焓值為117.4 J/g純玉米醇溶蛋白的吸熱峰溫度為83.39℃，焓值為107.2 J/g略低于復合顆粒，說明復合微粒的熱穩定性提高，這可能是由于百里香酚與玉米醇溶蛋白質之間形成新的作用力所導致的。

圖5 差示掃描量熱圖Fig.5 Differential scanning calorimetry

2.5 FTIR

圖6顯示了在4 000～400 cm-1范圍內玉米醇溶蛋白、百里香酚以及ZT復合微膠囊的紅外光譜圖。紅外光譜的峰形、位移發生的微小變化都可以表明分子間相互作用的發生。從圖中可以看出，在3 300 cm-1左右玉米醇溶蛋白以及ZT復合微膠囊都出現一個較強的吸收峰，根據之前的研究報道可知3 500～3 100 cm-1范圍內的譜帶歸屬于O-H的振動收縮[23]。玉米醇溶蛋白與百里香酚形成ZT復合顆粒以后，相較于純的玉米醇溶蛋白，該特征峰譜帶向低波數方向移動，主要是因為玉米醇溶蛋白中的酰胺基與百里香酚的羥基之間形成相互結合形成氫鍵，從而使該處的特征峰向低波數方向移動，可以說明百里香酚成功被玉米醇溶蛋白包埋，這與DSC的結果一致。

此外，玉米醇溶蛋白在酰胺Ⅰ帶(1 750～1 600 cm-1)以及酰胺Ⅱ帶(1 550～1 510 cm-1)也出現兩個特征峰，酰胺Ⅰ帶主要是由于C-O基團以及C-N的基團的伸縮振動形成的，酰胺Ⅱ帶主要是由于N-H基團以及C-N基團的彎曲振動形成的[24- 25]。從圖6中觀察到加入百里香酚形成ZT復合顆粒以后峰值的強度都有不同程度上的降低，并且兩個特征峰都向低波數方向移動，這些變化都表明玉米醇溶蛋白與百里香酚之間不僅有氫鍵作用，由于玉米醇溶蛋白含有較多的疏水性氨基酸，因此復合粒子中還有部分疏水作用以及靜電相互作用的存在[26]。

圖6 傅里葉紅外光譜圖Fig.6 Fourier infrared spectra

2.6 XRD

X-射線衍射分析主要用來分析物質的結晶狀態。百里香酚等活性物質被包埋的時候，其晶體狀態變成無定型狀態[27]。圖7是百里香酚、玉米醇溶蛋白以及ZT復合顆粒的X-射線衍射圖，由圖中可以看出玉米醇溶蛋白在2θ=9°以及19°的時候出現兩個較寬的衍射峰，而ZT復合顆粒的峰型與玉米醇溶蛋白相似，但是峰的強度較低，說明玉米醇溶蛋白以及ZT復合顆粒均為無定型結構[28]。百里香酚的XRD圖譜中有很多尖銳的峰出現，表明百里香酚在自然的狀態下是高度結晶的；但是，在ZT復合微膠囊的XRD圖譜中這些尖銳的特征峰完全消失，表明百里香酚被包埋之后是以無定型的狀態存在于包埋物中的，這與傅玉穎等[29]的研究結果一致。

圖7 X-射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction pattern

2.7 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率是體外抗氧化能力的測定方法，自由基清除率越高則抗氧化能力越強[30]。圖8顯示的是最優條件下(芯壁比1∶21.52，溶劑反溶劑混合體積比1∶5，滴加速率1.2 mL/min)制備的樣品對DPPH的清除率。結果表明：隨著ZT含量的增加，自由基清除率逐步增加，在樣品添加量為2.5 mg時清除率可達47.29%±0.71%。該結果也說明百里香酚被成功包埋并保持了原有的生物活性。

圖8 DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate

3 結論

本文通過反溶劑法成功制備玉米醇溶蛋白-百里香酚復合微膠囊，并對其制備工藝進行優化，在最佳的工藝(芯壁比1∶21.5，溶劑反溶劑混合體積比1∶5，滴加速率1.2 mL/min)條件下制備的復合微膠囊，具有較高的包封率為54.04%±2.27%。粒徑分布圖顯示復合微膠囊粒子大小更均勻。DSC、FTIR以及XRD則證實百里香酚被成功包埋，百里香酚是通過氫鍵、靜電相互作用以及疏水作用嵌入到玉米醇溶蛋白之內的。DPPH自由基清除率結果表明該方法制備的復合粒子可以有效地保持芯材的生物活性；因此，將玉米醇溶蛋白作為活性物質的有效載體，可以對百里香酚等活性物質達到有效的包埋，提高百里香酚的穩定性以及生物利用率。