微生物菌劑對設施辣椒秸稈原位堆肥土壤理化性質及細菌群落的影響

李雪菲 靳 拓 張 凱 嚴昌榮 丁超武 劉 勤*

(1.中國農業科學院 農業環境與可持續發展研究所， 北京 100081；2.農業農村部農膜污染防控重點實驗室， 北京 100081；3.農業農村部農業生態與資源保護總站，北京 100125；4.山東省農業生態與資源保護總站， 濟南 250131；5.山東成聚農業科技有限公司， 濰坊 262700)

設施農業的迅速發展同時產生了大量的農作物廢棄秸稈[1]。據統計全球每年約產生秸稈70億 t，我國每年產生秸稈超過10億 t。秸稈貯存時間短、運輸困難，在全國各地分布范圍廣，產出量大，進行系統回收和技術處理存在很大的難度[2]。“十三五” 期間提出秸稈綜合利用率要達到85%以上的目標，秸稈綜合利用技術得到迅速發展。但目前仍存在禁燒時段內時有焚燒、禁燒時段外大量集中焚燒的現象[3-4]。蔬菜秸稈中含有大量N、P、K和微量元素，富含營養物質和能量，將秸稈廢棄物發酵，經過技術處理后能成為很好的有機肥料，增加土壤肥力，促進農業綠色發展[5-7]。

堆肥技術是提高資源利用率、處理農業廢棄物的有效手段[8]。發酵堆肥是農業廢物被腐殖化的過程，在發酵升溫過程中殺死病原菌，促進有機物的腐熟[9]。有機物分解時，不僅生成含氮、磷、鉀的化合物，而且還生成重要的活性物質腐殖質[10]。蔬菜秸稈所含養分大多為蔬菜作物生長所需，參與堆肥后容易被吸收利用。我國農村經常將蔬菜秸稈進行堆料處理，然而，不添加任何輔料的自然堆肥材料配比不合理，發酵周期長，木質素分解不充分，還存在較嚴重的氮素流失，影響堆肥的質量，達不到無害化標準[11-12]。研究表明，秸稈堆肥前添加微生物菌劑可以加速堆肥升溫，提高產品成熟質量[13-15]。添加微生物菌劑可以加速農業廢棄物的降解，而且操作便捷，不會造成二次污染。微生物菌劑的應用對提高堆肥效率，改善農作物品質，發展綠色無公害農業具有重要意義[16]。

目前，國內工廠化堆肥發酵技術已經非常成熟，其相應的微生物菌劑研究也已有眾多優良菌群，然而，工廠化堆肥所需成本高，條件嚴格，技術需求高，不適合農戶小規模農業生產。研究耕層原位高效發酵秸稈對發展輕簡化秸稈還田技術具有重要意義。實現原位堆肥，要求農業廢棄物達到綠色循環利用標準。茄果類蔬菜生產普遍使用覆膜栽培。地膜具有增加地溫、抑制地表水分蒸發、抑制和消滅有害雜草等多方面功能[17-20]。2020年國內地膜覆蓋種植面積超過2 000萬hm2[21]。然而塑料地膜無法自然降解，回收率低，殘膜給秸稈還田工作造成負擔[22]。設施蔬菜生產時，利用生物降解地膜代替塑料地膜可有效解決殘膜污染和廢棄物難回收等問題[23-24]。生物降解地膜配合秸稈還田后進行堆肥，是一種低成本高效率的農業秸稈可持續利用技術[25-28]。與密閉好氧堆肥或厭氧發酵方式處理蔬菜秸稈比，原位堆肥不需要前期建設，并且可以避免秸稈收集運輸等環節的人力及經濟投入[29]。目前茄果類秸稈原位堆肥的研究尚少，特別是針對生物降解地膜覆蓋條件下，對堆肥各個階段細菌群落動態變化了解不深。因此，本研究選擇設施大棚生物降解地膜覆蓋下辣椒秸稈作為研究對象，通過在堆肥前添加不同劑量微生物菌劑，利用實驗室常規化學分析和16 s rDNA高通量測序技術分析方法，探明外源微生物菌劑添加對原位堆肥過程中的理化指標、土壤細菌優勢群落和群落結構多樣性的影響，確定最適微生物菌劑添加量，為解決設施大棚農業生產中廢棄秸稈資源化問題提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗設置在山東省壽光市馬家旗村。該地屬暖溫帶大陸性季風氣候，夏季高溫高濕，冬季干冷，年平均氣溫13.2 ℃，無霜期195 d，年平均降水量為708 mm，主要發生在6—8月。土壤類型為潮土，母質為密河沖積物。

1.2 試驗材料

原位堆肥所用干雞糞購于當地一家農場。辣椒秸稈從設施大棚前茬辣椒收獲后直接粉碎還田，覆蓋種植所用生物降解地膜主要材料為PBAT(聚對苯二甲酸-己二酸丁二醇酯)。利用秸稈粉碎還田機將秸稈粉碎后長度3～5 cm。辣椒秸稈還田量為10 000 kg/hm2。施用4 500 kg/hm2雞糞，旋耕30 cm 耕層土壤。灌水控制耕層含水量60%左右。堆肥原料的基本理化性質見表1。微生物菌劑由山東成聚農業科技有限公司提供，菌劑呈粉末狀，有效活菌數為每克10億個，主要成分為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

表1 堆肥原料的基本理化性質Table 1 The physicochemical properties of composting material

1.3 試驗設計

試驗溫室大棚內進行。試驗設5組處理，包括不添加秸稈和微生物菌劑(CT1)、不添加微生物菌劑(CT2)、150 kg/hm2微生物菌劑處理(CP1)、300 kg/hm2微生物菌劑處理(CP3)以及450 kg/hm2微生物菌劑處理(CP3)。每個處理設3個重復。供試大棚長200 m，寬3.3 m，脊高5 m。每組處理地塊長20 cm，寬3.3 m，前后設置保護行，各處理用田埂隔開。為確保樣品的代表性，在第1、4、10、21、31和51天采用隨機取樣法取樣。選擇堆肥發熱階段、高溫階段、降溫階段、腐熟階段4 個時期，收集土壤待提取DNA，進行微生物細菌相對豐度和微生物群落分析。

1.4 研究方法

1.4.1理化性質分析

使用IEDA-T3型環境溫度檢測儀(中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所)，將探針埋入耕層土壤深分別為5、15 和25 cm，每隔24 h測定1次，選擇上午10：00土壤溫度數據繪制溫度曲線。采用包世德[30]的方法對土壤的理化性質進行分析。樣品的pH和EC值,pH用pH計測定。總有機碳(TOC)含量用重鉻酸鉀法測定，總氮(TN)含量用凱氏定氮法測定。

1.4.2土壤DNA提取及PCR擴增

每個樣品取0.5 g土樣采用土壤DNA分離試劑盒提取土壤微生物基因組DNA，完成抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量和濃度。以提取的基因組DNA為模板，用引物序列338F和806R擴增細菌16S rDNA基因的高變區V3-V4[31]。

1.4.3測序分析

基因組DNA由北京奧維森基因科技有限公司完成Mi Seq高通量測序，對獲得的數據通過序列拼接、過濾和去嵌合體得到優化序列，進行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類及各分類水平注釋[32]。

1.4.4統計分析

采用QIIME軟件計算每個土壤樣本中細菌群落的α多樣性值。采用R軟件中的加權UniFrac距離對數據進行熱圖聚類和PCA分析。采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析ANOVA和主成分分析，方差分析多重比較采用最小顯著差異(LSD)法，在P<0.05水平下檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 微生物菌劑投入量對農田土壤溫度的影響

堆肥期間土壤最高溫度及持續時間可以反映堆肥系統中微生物的活躍能力，取耕層土壤深5 cm，15 cm和25 cm處溫度平均值為土壤溫度，結果見圖1。可知土壤溫度變化可將堆肥過程分為4個階段，分別為升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期。堆肥期間產生2個溫度峰值，分為氧氣充足(堆肥第0～30天)和氧氣不足(堆肥第31～51天)2個階段。堆肥初期土壤溫度迅速上升，在堆肥第22 天左右，所有處理土壤溫度達到峰值，后下降至33 ℃左右；在第30天由于棚內氧氣不足，厭氧菌迅速增加，溫度回升，第31～41天達到第二個高峰期，后迅速下降，在堆肥腐熟期穩定在31 ℃左右。從地溫的變化可以看，堆肥過程中，CP1、CP2和CP33 組處理地溫都較CT1和CT2高，其中CP3處理的地溫在5組處理中最高，CT1最低。堆肥全過程CP1，CP2和CP3的最高溫度比CT2分別高2.00、1.95和0.24 ℃；CT2最高溫度比CT1高0.87 ℃。由于試驗在設施大棚中進行，土溫受天氣條件影響，陰雨天氣土溫偏低，因此堆肥期間溫度有所起伏，高溫期比較短暫。

CT1，不添加秸稈和微生物菌劑；CT2，不添加微生物菌劑；CP1，150 kg/hm2微生物菌劑處理；CP2，300 kg/hm2微生物菌劑處理；CP3，450 kg/hm2微生物菌劑處理。下同。CT1, without straw and microbial agents; CT2, without microbial agents; CP1, 150 kg/hm2 microbial agent treatment; CP2, 300 kg/hm2 microbial agent treatment; CP3, 450 kg/hm2 microbial agent treatment. The same below.

2.2 微生物菌劑投入量對土壤理化性質的影響

堆肥期耕層土壤pH和EC的變化見圖2。由圖2(a)可知：堆肥期間所有處理堆肥初期pH為弱堿性，堆肥升溫期小幅上升，堆肥高溫期維持在8.5～9.0，在堆肥中期逐漸下降，腐熟期達到最低；堆肥結束時所有處理pH呈中性，其中CT1顯著低于其他處理(P<0.05)。由圖2(b)可知：堆肥升溫期和降溫期各處理EC值在0.5 ms/cm左右波動，在堆肥降溫期迅速上升，在堆肥終點達到峰值。堆肥第31天各處理無顯著性差異，但堆肥終點各處理存在顯著差異，CP2和CP3的EC值顯著高于其他3組處理；與堆肥前比較，CT1，CT2，CP1，CP2和CP3分別提高了1.22、1.55、1.25、1.37和1.86 ms/cm。五組處理在堆肥后的EC都低于2.5 ms/cm，符合無害化標準。微生物菌劑提高堆肥電導率，微生物菌劑添加量與EC值成正比。

圖2 堆肥期耕層土壤pH(a)和電導率(b)的變化特點Fig.2 Characteristics of pH (a) and EC (b) in the topsoil during in-situ composting

堆肥期耕層總有機碳(TOC)和總氮(TN)的變化見圖3。CP2、CP3和CT1處理組的有機碳含量降低最為顯著。在整個堆肥過程中，CT1、CT2、CP1、CP2和CP3組的總有機碳含量分別下降了63.0%、41.5%、39.1%、39.1%和40.6%。CT1中有機碳含量下降幅度最大，其次是CT2、CP3。堆肥終點的TOC含量各處理沒有顯著差異(P<0.05)，說明微生物菌劑的添加對總有機碳的分解沒有影響。

由圖3(b)可知，堆肥初期，CP2的TN含略有下降，其他處理的TN含量均提高，于堆肥第11天到達第一個峰值。第11 天后，各處理的TN含量開始下降，到堆肥中期又回升，在堆肥第31天左右達到第二個峰值。第31 天后TN小幅平穩下降，到堆肥終點達到穩定。五組處理堆肥腐熟時TN含量與堆肥前相比均有所提高，CT1、CT2、CP1、CP2和CP3組的總氮含量在腐熟期無顯著性差異，但在堆肥中期總氮消耗量，添加微生物菌劑的處理顯著高于對照(P<0.05)。

圖3 堆肥期耕層總有機碳(TOC)(a)和總氮(TN)(b)的變化特點Fig.3 Characteristics of TOC (a) and TN (b) in the topsoil during in-situ composting

2.3 微生物菌劑投入量對土壤微生物的影響

2.2.1門水平上的主要細菌分布

不同菌劑添加量處理下不同典型發酵階段在門水平上的細菌群落結構如圖4所示。可見：辣椒秸稈堆肥期間在門水平上的相對豐度超過1%的細菌種類有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。不同發酵階段細菌優勢菌群和含量存在顯著差異(P<0.05)。堆肥升溫期變形菌門(42.8%～44.3%)，其次是厚壁菌門(15.4%～25.0%)。高溫期厚壁菌門(22.9%～61.8%)，綠彎菌門(9.5%～45.2%)和變形菌門(12.2%～21.0%)為優勢菌群。降溫期綠彎菌門(23.1%～66.8%)和變形菌門(11.2%～29.8%)成為優勢菌群。腐熟期變形菌門(29.9%～31.7%)，綠彎菌門(16.1%～20.1%)和芽單胞菌門(13.8%～17.6%)相對豐度最高。

變形菌門數量在堆肥升溫期最高，高溫期迅速降低，五組處理數量最低時與堆肥前比降低了71.9%、58.7%、74.5%、76.9%和55.4%，降低幅度CP2>CP1>CT1>CT2>CP3，堆肥中后期逐漸數量回升。微生物菌劑對辣椒秸稈原位堆肥高溫期變形菌門數量有顯著影響，在添加300 kg/hm2處理中變形菌門數量降低最多。添加微生物菌劑的CP1，CP2和CP33組處理，在堆肥高溫期厚壁菌門與堆肥前相比相對豐度顯著增高，分別提高了 1.66、2.68、1.56倍。綠彎菌門在堆肥中后期的數量最多，不同處理的峰值時期存在差異。CT1在堆肥高溫期綠彎菌門占比最多，占45.16%。其他4組處理在堆肥降溫期綠彎菌門占比最多，CT2、CP1、CP2、CP3分別占全部細菌的23.09%、36.32%、66.84%、29.04%，可知綠彎菌門在CP2處理中作用最顯著。

2.2.2屬水平上的主要細菌分布

不同菌劑添加量處理下不同典型發酵階段在屬水平上的細菌群落結構如圖5所示。可知：辣椒秸稈堆肥期間在屬水平上的相對豐度超過1%的細菌種類有克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單孢菌屬(Pseudomonas)。不同發酵階段細菌優勢菌群和含量存在顯著差異。堆肥升溫期優勢細菌為克雷伯氏菌屬(6.1%～14.2%)；高溫期為不動桿菌屬(0.9%～7.0%)，降溫期為綠彎菌屬(1.0%～3.1%)，腐熟期為芽單胞菌屬(2.5%～4.0%)。

圖5 堆肥不同時期土壤屬水平主要細菌分布Fig.5 Distribution of main bacteria at genes level in different composting periods

噬冷桿菌屬(Psychrobacter)在升溫期存在少量，隨著堆肥溫度升高幾乎消失。假單胞菌屬在堆肥升溫期最高，高溫期迅速降低，五組處理數量最低時與堆肥前比降低了1.5%、5.0%、6.3%、7.6%、3.9%，CP2處理假單胞菌屬降低幅度最大。不動桿菌屬在各處理腐熟期豐度無顯著差異，但是在堆肥高溫期，添加微生物菌劑的處理下降更快，五組處理在高溫期分別下降了-3.5%、1.4%、8.3%、4.7%、8.9%。

2.2.3細菌科水平樣本聚類分析

由圖6可知，不同堆肥發酵時期的細菌相對豐度在科水平上明顯分離，升溫期與其他三個時期細菌組成差異最大。在堆肥降溫期，CT1和CT2兩種處理與堆肥腐熟期的細菌聚類分布更接近， CP2、CP3兩組處理細菌組成上堆肥降溫期和高溫期的細菌分布更接近。添加微生物菌劑的處理在降溫期的厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)豐度最高，降溫期添加300 kg/hm2處理的厭氧菌在所有處理中最高。由于微生物菌劑的主要成分是芽孢桿菌，因此在同一發酵時期添加微生物菌劑的處理芽孢桿菌科(Bacillaceae)顯著高于對照(P<0.05)，芽孢桿菌科含量與微生物菌劑添加量成正比。

圖6 堆肥不同時期科水平細菌群落的相對豐度Fig.6 Relative abundance of the bacterial communities at the family level at different composting periods

2.2.4PCA主成分分析

評價微生物群落之間差異的PCA主成分分析結果見圖5。可知：堆肥升溫期所有處理聚在一組，其中CP1、CP2和CP3距離接近，CT2最遠。堆肥高溫期所有處理聚在一組，其中CP2相對CT1和CT2最遠。堆肥降溫期和堆肥腐熟期所有處理聚在一組，其中堆肥降溫期CP2相對其他處理最遠，堆肥腐熟期各處理沒有顯著差異。對于堆肥過程的細菌，同一處理下不同發酵階段的細菌組成存在顯著差異，不同處理下同一發酵階段細菌組成結構類似。微生物菌劑對細菌群落結構的影響主要體現在在堆肥升溫期和降溫期，其中添加300 kg/hm2微生物菌劑的處理對細菌群落的影響最顯著。

3 討 論

微生物菌劑投入能提高堆肥土壤高溫期溫度峰值，與龔建英等[33]研究一致。本研究得出添加300 kg/hm2和450 kg/hm2微生物菌劑處理對提高堆肥升溫期土壤最高溫度效果更顯著(P<0.05)。已有研究表明添加微生物菌劑能夠提高堆肥土壤的pH，pH主要通過影響微生物的活性來影響堆肥過程[34]。大多數微生物生長的最優pH范圍在6.7～9.0內，也是堆肥物料發酵適宜的范圍[35]。pH大小不僅影響有機物質分解及微生物活動強度，而且直接影響酶參與的生化反應速度[36]。本試驗樣品在堆肥前都呈現弱堿性，然而，隨著堆肥材料的分解和成熟以及腐殖酸的產生，pH逐漸降低并趨于穩定。在堆肥期結束時所有處理pH為6.8～7.2，適合辣椒生長。細菌豐度與土壤有機碳、氮含量有關[37]。土壤中絕大多數的微生物，依賴于分解土壤有機質來獲取能量[38]。由圖3(a)曲線可知，堆肥升溫期所有處理組的TOC含量迅速降低，分析原因為土壤存在大量的活性嗜熱微生物，堆肥初期有機碳被好氧微生物降解及同化，生成相對穩定的腐殖質[39]。堆肥中氮元素的轉移是衡量堆肥質量的重要方式。氮素損失不僅會使堆肥養分散失，產生的氣體還會污染環境[40]。堆肥腐熟時TN含量與堆肥前有所增加，是因為微生物菌劑中存在氨化細菌，可以有效控制氮素的損失，減少氨氣揮發，起到固氮保肥的作用[41]。微生物菌劑有助于辣椒秸稈堆肥過程中氮素的保持，但不同添加量對氮素保持的效果無顯著差異。

圖7 PCA主成分分析Fig.7 PCA principal component analysis

微生物菌劑對細菌群落結構的影響主要體現在在堆肥升溫期和降溫期。微生物菌劑能夠顯著增加高溫期厚壁菌門，加快消耗變形菌；增加降溫期厭氧菌門(Anaerolineales)和芽孢桿菌門(Bacillales)豐度。各優勢菌群在堆肥不同時期起到不同作用。變形菌與C、N代謝有關，可加速堆肥過程中有機物的降解[42]。微生物菌劑對辣椒秸稈原位堆肥高溫期變形菌相對豐度有顯著影響，在添加300 kg/hm2處理中變形菌相對豐度降低最多。厚壁菌門有很多能夠抑制作物病害的細菌，例如芽孢桿菌[43-44]。芽孢桿菌能生產大量抗生素，為作物生長提供需要的營養。添加微生物菌劑的處理增加了土壤中芽孢桿菌的數量。綠彎菌主要參與大氣CO2的固定和纖維素的分解，同時參與氮的硝化作用[45]。綠彎菌門在堆肥中后期的數量最多，不同處理的峰值時期存在差異，在CP2處理中發揮最顯著的作用。本試驗以雞糞為原料，堆體擬桿菌門豐度較高，與趙彬涵等[46]研究一致。

4 結 論

本研究通過添加不同劑量微生物菌劑對設施大棚辣椒秸稈進行原位堆肥，測定堆肥期間耕層土壤理化性質，并使用16 s rDNA 高通量測序技術對堆肥過程四個典型發酵階段中的細菌多樣性進行了分析，結論如下：

在辣椒秸稈耕層堆肥試驗中添加外源微生物菌劑提高了堆肥期間耕層土壤溫度，提高了土壤可溶性鹽的含量，促進了總氮(TN)的固定，有效減少氮素損失，保證了堆肥的質量。變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)是辣椒秸稈耕層堆肥過程在門水平上的優勢細菌。克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單孢菌屬(Pseudomonas)是屬水平優勢細菌。微生物菌劑對細菌群落結構的影響主要體現在在堆肥升溫期和降溫期。微生物菌劑能夠顯著高溫期厚壁菌，大量消耗變形菌；增加降溫期厭氧菌(Anaerolineales)和芽孢桿菌(Bacillales)豐度。

CP2處理堆肥最高溫度與對照提高1.95 ℃，和堆肥前相比提高了1.37 ms/cm電導率和24.1%總氮，變形菌門和厚壁菌門變化在所有組內最顯著，對細菌群落的影響最顯著。300 kg/hm2微生物菌劑為辣椒秸稈耕層堆肥最適添加量。