小鼠感染BVDV誘導NLRP3炎癥小體的表達及其對病毒復制的影響

劉思雨 張月瑩 黃 江 崔月琦 劉 宇，2 周玉龍，2 朱戰波，2* 張澤財，2*

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶，163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術研究中心，黑龍江 大慶，163319)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛胃腸道、呼吸道和生殖疾病的重要病原體，它所引起的疫病呈世界性分布，給養牛業造成了持續的經濟損失[1-2]。BVDV可以引起宿主動物的免疫抑制和持續性感染，從而促進牛群中BVDV的循環。BVDV進化出了多種策略來逃避宿主的先天性免疫[3-4]。

已有研究表明BVDV感染的BALB/c小鼠在第14天時仍可在體內檢測到病毒[5]。同時，Lee等[6]研究發現，BVDV感染的BALB/c小鼠脾臟出現明顯的病理組織學變化，骨髓中巨核細胞數量也明顯增加。另外，2016年，Choi等[7]研究也證實BVDV感染的BALB/c小鼠在第9天時仍可以在脾臟和腸系膜淋巴結中檢測到病毒抗原。近期研究也證實BVDV感染的BALB/c小鼠在第7天時出現明顯的病毒血癥[8]。此外，本研究團隊前期研究顯示，致細胞病變(CP)型和非致細胞病變(NCP)型BVDV感染的小鼠均呈現白細胞、淋巴細胞和血小板的減少，以及病毒血癥[9]，表明BALB/c小鼠可以作為感染模型用于BVDV致病機制的研究。

先天性免疫是機體抵御病原微生物入侵的第一道防線，在抗感染免疫中發揮關鍵的作用。研究證實，宿主先天性免疫受體可通過識別入侵的BVDV粒子，進而啟動一系列免疫反應，發揮抗病毒效果。NLRP3炎癥小體是先天性免疫中重要模式識別受體，是由NLRP3受體、適配器ASC和Caspase-1組成的寡聚復合體。組裝后的NLRP3炎癥小體將會觸發pro-Caspase-1自切割為成熟的Caspase-1，隨后，介導IL-1β的分泌，對宿主抵御微生物至關重要[10]。越來越多的研究證實，NLRP3炎癥小體參與多種病毒的致病機制，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒，呼吸道合胞病毒和豬瘟病毒等[11-13]。然而BVDV體內感染后NLRP3炎癥小體的活化規律，國內外尚未見報道。本研究擬探究BVDV感染后誘導NLRP3炎癥小體激活的規律，以及NLRP3炎癥小體激活與病毒復制的相關性，為BVDV拮抗宿主先天性免疫的機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒株和實驗動物

BVDV標準株NADL(CP型)由黑龍江省牛病防控工程技術研究中心保存。4～6周齡雌性的SPF級BALB/c小鼠購自哈爾濱醫科大學實驗動物醫學部。

1.2 主要試劑

兔源NLRP3單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔源Caspase-1和IL-1β單克隆抗體購自安諾倫生物技術有限公司；山羊抗兔IgG/辣根酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒、SYBR熒光定量qRT-PCR試劑盒購自Takara公司。

1.3 動物分組和處理

將BALB/c小鼠在隔離器中預飼喂適應一周后，隨機分成8組，即1個對照組和7個攻毒組，每組各5只。攻毒組每只腹腔注射105TCID50的CP型BVDV，對照組注射等量的PBS，小鼠自由采食和飲水。在攻毒后的不同時間點(0、6、12、24、48、96、168和240 h)分別采集小鼠的十二指腸、脾臟和血液。所有試驗均獲得黑龍江八一農墾大學動物倫理委員會批準。

1.4 熒光定量PCR檢測NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA表達

無菌取攻毒后不同時間點小鼠的十二指腸進行研磨，提取總核糖核苷酸(RNA)，通過逆轉錄反應合成互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)，以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應；β-actin為內參。引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Real-time PCR

反應條件：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，水9.5 μL，上下游引物各1 μL，目的模板1 μL共25 μL體系在95 ℃預變性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s條件下共40個循環。SteponePlus軟件測定其Ct值，將正常對照組設定為1，采用2-ΔΔCt法分析進行mRNA表達水平，ΔΔCt=試驗組(Ct目的基因-Ct內參基因)-空白組(Ct目的基因-Ct內參基因)。

1.5 Western Blot分析NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達

取攻毒后24 h和168 h(7天)小鼠十二指腸，加入細胞裂解液，提取蛋白。取30 μg樣品進行80 V恒壓電泳40 min，然后120 V恒壓電泳45 min，切下目的蛋白凝膠并轉印至PVDF膜，5%的脫脂乳封閉2 h后分別加入一抗為兔源的NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)的單克隆抗體和兔源的Tubulin(1∶5 000)的單克隆抗體4 ℃過夜。加入1∶8 000稀釋的山羊抗兔的二抗后，37 ℃孵育1 h，使用ECL顯色劑對膜進行顯色，于凝膠成像儀中進行曝光成像，得到灰度值，計算相對表達量。

1.6 熒光定量PCR檢測小鼠十二指腸、脾臟和血液的病毒載量

取攻毒后不同時間點小鼠的十二指腸、脾臟進行研磨并將小鼠眼球采集抗凝血，提取總RNA通過逆轉錄反應合成cDNA，以cDNA為模版，進行熒光定量PCR反應。BVDV引物序列，上游為：5′-GAGTACAGGGTAGTCGTCAG-3′，下游為5′-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3′，擴增長度130 bp。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共35個循環，根據標準曲線Y=-2.909 4X-40.812計算出病毒載量。

1.7 十二指腸和脾臟病理組織學檢查

在病毒感染第7天時，無菌采取對照組和感染組的十二指腸和脾臟，將其在4%的多聚甲醛中固定一周后經沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、蘇木素-伊紅染色、封片等步驟，制作組織切片并觀察。

1.8 統計分析

2 結果與分析

2.1 BVDV感染小鼠體內NLRP3、Caspase-1和IL-1β基因表達情況

qRT-PCR結果表明，小鼠感染BVDV后十二指腸中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達量從第12 h開始逐步升高，24 h時達到高峰(P<0.05)；在感染第48 h和96 h(4 d)時，其基因表達與對照組相比并無明顯的變化(P>0.05)；但在感染第168 h(7 d)時，其表達量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，感染第240 h(10 d)時略有升高但仍低于對照組(圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測BVDV感染早期小鼠十二指腸NLRP3(a)、Caspase-1(b)和IL-1β(c)的mRNA表達水平Fig.1 Relative mRNA levels of NLRP3 (a), Caspase-1 (b) and IL-1β (c) by qRT-PCR in the early stage of BVDV infection

2.2 BVDV感染小鼠體內NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達情況

由圖2可知，Western Blot檢測發現腹腔注射BVDV的小鼠在24 h時，小鼠十二指腸中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達水平與對照組相比顯著升高(P<0.05)。由圖3可知,其變化趨勢與mRNA表達水平的結果相一致；當BVDV感染第168 h(7 d)時，小鼠十二指腸中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達水平與對照組相比顯著降低(P<0.05)。此變化趨勢與mRNA表達水平的結果相一致。上述結果表明BVDV感染早期，小鼠體內的NLRP3-(Caspase-1)/IL-1β信號通路被激活，感染第168 h(7 d)時，NLRP3炎癥小體活化被抑制。

1和2分別代表各組中2個不同小鼠的十二指腸樣本。1 and 2 represent duodenal samples from 2 different mice in each group.

1和2分別代表各組中2個不同小鼠的十二指腸樣本。1 and 2 represent duodenal samples from 2 different mice in each group.

2.3 小鼠體內病毒含量的檢測

qRT-PCR結果表明，BVDV感染早期的小鼠十二指腸和脾臟中病毒載量逐漸升高。在感染的168 h(7 d)十二指腸、脾臟和血液中病毒載量均達到高峰(圖4)。

圖4 小鼠十二指腸(a)、脾臟(b)和血液(c)病毒載量Fig.4 Viral load in the duodena (a), spleen (b) and blood (c) of all infected mice

2.4 小鼠十二指腸、脾臟病理組織學變化

與空白對照組小鼠相比較，BVDV感染后第7天小鼠十二指腸呈現為腸腺上皮大量壞死，基層變厚并且有較多的炎性細胞浸潤；脾臟可見淋巴細胞變性、壞死，間質疏松和水腫(圖5)。

(a)小鼠十二指腸對照組與感染組；(b)小鼠脾臟對照組與感染組

3 討 論

NLRP3炎癥小體是目前研究最多的NLR家族成員[14]，炎癥小體的活化包含2個步驟：首先，宿主細胞對微生物的模式識別誘導了pro-IL-1β和NLRP3的轉錄[15]；其次，危險信號激活炎癥小體，導致Caspase-1的活化，并將細胞因子前體切割為成熟的具有生物活性的IL-1β和IL-18，以及觸發細胞焦亡[16-17]。IL-1β作為炎癥反應上游的細胞因子，能夠促進炎癥反應并起到清除病原體的作用[18-19]。本研究發現，與空白對照組相比，小鼠感染BVDV早期NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平隨時間推移逐步升高，在感染后24 h的mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于對照組，表明BVDV感染早期可以導致小鼠體內NLRP3炎性小體激活。

NLRP3炎癥小體在許多抗病毒免疫中被激活，然而，研究表明NLRP3炎癥小體的活化在不同病毒致病機制中發揮的作用可能存在差異。Cui等[20]研究證實，ZIKV感染可以通過介導NLRP3炎癥小體激活促進cGAS的降解，進而抑制Ⅰ型干擾素的產生，導致ZIKV逃避宿主抗病毒反應。另外，有研究表明，丙型肝炎病毒具有抑制LPS誘導的NLRP3炎癥小體活化的作用[21]。近期研究也證實，甲型流感病毒感染小鼠1周時，NLRP3和Caspase-1的表達比感染早期進一步升高，IL-1β的轉錄和分泌也進一步增強，促進了甲型流感病毒感染[22-23]。本研究中，與許多前期研究結果相似的是，在BVDV感染早期，NLRP3炎癥小體被激活，然而在BVDV感染小鼠的第7天，發現NLRP3、Caspase-1和IL-1β基因和蛋白的表達量均明顯降低。

進一步對小鼠血液、脾臟和十二指腸中病毒載量進行檢測發現，感染早期的小鼠十二指腸和脾臟中病毒載量逐漸升高，血液中病毒載量逐漸下降。然而，在BVDV感染的第7天病毒載量均達到高峰，這與實驗室前期構建的BVDV感染小鼠模型結果相一致[9]。通過病理組織學檢查證明BVDV感染后引起了病理損傷，感染模型成立。NLRP3炎癥小體活化及病毒載量變化規律表明NLRP3炎癥小體在病毒感染早期被激活后，在一定程度上抑制了病毒的復制，但對病毒感染后期抑制效果不明顯。值得注意的是，小鼠十二指腸、脾臟和血液的病毒載量在感染第7天最高，第10天的病毒載量開始下降，可能是特異性免疫應答被激活，其機制有待于進一步研究。

綜上所述，在小鼠體內，BVDV感染早期的NLRP3炎性小體被激活，然而隨著宿主體內病毒載量增加，可能對其激活具有一定的抑制作用。本研究初步揭示了BVDV感染與NLRP3炎癥小體活化的相關性，為BVDV拮抗宿主先天性免疫的機制研究奠定了基礎。然而，BVDV感染本體動物后NLRP3炎癥小體激活及其抗病毒機制仍有待于進一步研究。