東印度洋、南海海域鳶烏賊種群遺傳結構研究

趙 炎，王叢叢，2，3，4，5，劉必林，2，3，4，5，林龍山，李 淵

（1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.大洋漁業資源可持續開發教育部重點實驗室，上海 201306；3.國家遠洋漁業工程技術研究中心，上海海洋大學，上海 201306；4.農業農村部大洋漁業開發重點實驗室，上海 201306；5.農業農村部大洋漁業資源環境科學觀測實驗站，上海 201306；6自然資源部第三海洋研究所，福建廈門 361005）

鳶烏賊（Sthenoteuthis oualaniensis）隸屬于軟體動物門（Mollusca），頭足綱（Cephalopoda），鞘亞綱（Coleoidea），槍形目（Teuthoidea），柔 魚科（Ommastrephidae），鳶烏賊屬，廣泛分布于赤道太平洋、印度洋等海域，其中以印度洋西北部和中國南海海域資源最為豐富［1－2］。鳶烏賊作為次要經濟種，潛在資源量尤為可觀，南海鳶烏賊潛在資源量約為457萬t［3］，西北印度洋鳶烏賊潛在資源量約為1 000萬t［4］，具有極大的潛在商業價值。近年來，關于鳶烏賊的漁業資源［5－6］、漁業生物學［7］、營養生態位［8］、角質顎生長特性［9］、耳石微結構及微量元素［10－12］等方面的研究日趨完善。

鳶烏賊種群結構十分復雜，種群內除了不同產卵群外，尚具有不同的體型群，且分布較為廣泛。劉金立等［13］對西北印度洋海域兩個鳶烏賊種群的遺傳結構進行分析，發現兩個種群內遺傳變異較高，且種群遺傳背景差異顯著。李敏等［14］利 用 線 粒 體NADH（nicotinamide adenine dinucleotide）脫氫酶亞基2基因（ND2）的全序列對南海兩個表型群遺傳結構進行研究，發現兩個種群之間存在顯著遺傳分化，但是各類群分布范圍高度重合，不存在地理差異。劉連為等［15］采用線粒體細胞色素b基因對東海、南海與菲律賓3個地理區域的鳶烏賊群體進行遺傳研究發現，3個地理群體間遺傳差異顯著，在漁業管理上應劃分為不同單元。李敏等［16］利用線粒體ND2、細胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase subunit I，CO I）和16S核糖體DNA序列對南海的鳶烏賊進行種群遺傳結構分析，研究發現，該海域兩個形態學群體（中型群和微型群）分布區域重合但是遺傳分化顯著，其中中型群和微型群遺傳分化達到種間水平，揭示該海域地理群體分布不單一的現象。

總體而言，關于鳶烏賊的遺傳結構研究主要集中在南海、印度洋西北部和太平洋海域［13－17］，缺乏對東印度洋鳶烏賊的研究，且該海域鳶烏賊群體與其他海域群體間的關系也尚不明確。東印度洋赤道海域洋流模式復雜［18］，使得東印度洋赤道海域可能存在不同的種群遺傳模式。Cytb基因是廣泛應用于種群遺傳結構研究以及分子系統地理學研究重要分子標記［19－21］。因此，本研究采用Cytb基因序列來檢測東印度洋赤道和南海海域的鳶烏賊種群遺傳結構，以期填補東印度洋海域研究空缺，也期望為鳶烏賊漁業資源的可持續利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 站點位置與采樣時間

本研究所用鳶烏賊樣本共120尾，其中鳶烏賊群體1（東印度洋北部）、2（東印度洋南部）采集于東印度洋赤道海域（60尾，88°E～92°E、2°N～5°S），群體3（南海南部）、4（南海北部）采集于南海海域（60尾，112°E～117°E、11°N～20°N），存放于船艙冷庫并運回實驗室。采樣及分組情況見表1。

表1 鳶烏賊樣本站點信息Tab.1 Sample site information of S.oualaniensis

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

實驗中剪取背部或腹部肌肉組織，置于無菌離心管中，保存于冰箱備用。采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）提取鳶烏賊基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，用紫外分光光度計檢測（NanoDrop2000C）DNA濃度以及純度A260/A280值，－80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2.2 PCR擴增與測序

參照NCBI（National Center for Biotechnology Information）上傳的鳶烏賊線粒體DNA序列中Cytb基因，序列號：NC＿010636.1，使用Primer5.0軟件自行設計引物。引物序列為：

上游引物F：TGTTTAGTCGTTCAAGTGGCT

下游引物R：ACACTCAACACTCGACCGATC

PCR（polymerase chain reaction）反應體系為25μL體系，其中Taq PCR Master Mix（2×）15 μL，上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，DNA模板0.1μL，用ddH2O補足至25μL。PCR反應程序：預變性94℃、2 min；變性94℃、30 S，退火58℃、45 S，延伸72℃、45 S，30個循環；最后延伸72℃、2 min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計（NanoDrop 2000C）檢測其濃度和A260/A280值。選取合格樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化并進行雙向測序。

1.3 數據分析

測序結果經過拼接之后，使用MEGA 7.0軟件進行校對并加以人工比對，序列整理校對之后計算DNA的堿基組成、個體間以及種群間的遺傳距離。使用DNASP 5.0軟件計算單倍型多樣性指數（h）、單倍型數、核苷酸多樣性指數（π）等遺傳多樣性指數。構建單倍型NJ（neighborjoining tree）進化樹和最小跨度樹，揭示不同單倍型之間的連接關系，由NetWork 10.2軟件完成。利用Arlequin 3.5.2軟件進行AMOVA（analysis of molecular variance）、兩兩群體之間的遺傳分化系數Fst（F-statistics）（重復次數1 000次）、Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗和核苷酸不配對分布的估算。

2 結果與分析

2.1 Cytb基因片段序列分析

實驗結果分析校對之后共獲得120條序列，長度為757 bp，T、A、C、G堿基平均含量分別為36.9%、30.3%、15.2%、17.6%，其中A＋T含量（67.2%）明顯高于C＋G含量（32.8%）（表2）。在120條Cytb基因片段中共檢測到484個變異位點，其中包括單堿基變異位點31個，簡約信息位點453個，無插入和缺失，轉換和顛換分別為90個和109個。全部120條分析的序列一共定義了84個單倍型，其中單倍型H1、H5為S1和S2共有，單倍型H43、H44、H47、H49和H52為S3和S4共有；單倍型H2和H9為S1獨有，單倍型H22為S2獨有，單倍型H46為S3獨有，單倍型H81為S4獨有；其余單倍型僅為群體中單個個體具有，且沒有4個群體共享單倍型。

表2 鳶烏賊Cytb基因片段序列組成Tab.2 Sequence composition of Cytb gene of S.oualaniensis

2.2 種群遺傳多樣性

基于Cytb基因片段所有序列得到的4個群體總的單倍型多樣性指數（h）、單倍型數、核苷酸多樣性指數（π）和平均核苷酸差異數（k）分別為0.981、84、0.273 32、196.794。由表3可以看出，S3、S4的單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數和平均核苷酸差異數均高于S1和S2，尤其是核苷酸多樣性指數和平均核苷酸差異數顯著高于其他兩個群體。

表3 基于Cytb基因片段序列的鳶烏賊遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity index of S.oualaniensis based on Cytb sequence

AMOVA分析結果表明，來自群體間的遺傳變異為54.90%，且遺傳分化顯著（P＜0.01），來自群體內部的遺傳變異為45.10%，地理隔離導致的遺傳變異要略高于群體內部個體間的變異（表4）。

表4 基于Cytb基因序列的鳶烏賊群體AMOVA分析Tab.4 AMOVA analysis of S.oualaniensis based on Cytb sequence

評估群體間的遺傳分化常用遺傳分化系數（Fst），其取值范圍在0～1之間，數值大小與遺傳分化程度成正比［22］。根 據WRIGHT和MAXSON［23］的研究，本文中兩兩群體間的Fst分析表明（表5），S1與S2兩個群體間有中等程度遺傳分化；S3與S4兩個群體間沒有遺傳分化；東印度洋群體S1和S2與南海群體S3和S4之間遺傳分化很大。

表5 基于Cytb基因序列的鳶烏賊群體間遺傳分化系數（F st）分析Tab.5 F-statistics（F st）analysis among populations of S.oualaniensis based on Cytb sequence

基于Cytb基因序列構建的分子系統發育樹顯示，120個個體聚為3類。絕大多數S1、S2聚為一類；S1中有5個個體與S3、S4部分個體親緣關系較近；剩余S3、S4個體聚為一類（圖1）。Cytb單倍型最小跨度樹呈現星狀結構，單倍型之間通過多步突變或單一突變彼此相連接，S1和S2形成一個單倍型組群，S3和S4形成兩個單倍型組群（圖2）。

圖1 基于Cytb基因序列的鳶烏賊分子系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of S.oualaniensis based on Cytb sequence

圖2 基于Cytb基因序列的鳶烏賊單倍型最小跨度樹Fig.2 Reduced median network showing genetic relaionship in S.oualaniensis based on Cytb sequence

2.3 群體歷史動態

Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗的D值和Fs值均為負值，且統計檢驗如果均顯著，就可以證明該鳶烏賊群體近期內可能經歷過歷史擴張。結果表明（表6），僅S2滿足該條件，對該群體核苷酸不配對分布進行分析可得，核苷酸不配對分布圖呈現單峰類型（圖3），S1、S3、S4均呈現雙峰。上述結果顯示，S2群體可能經歷群體擴張。核苷酸分歧速率按照2.15%/百萬年～2.60%/百萬年，基于Cytb核苷酸不配對分布可以得到τ值為2.429，計算得到S2的種群擴張時間為7.3萬年前—6.1萬年前。

表6 鳶烏賊Cytb序列的中性檢驗Tab.6 Result of neutrality test on Cytb sequences of S.oualaniensis

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性及種群遺傳結構

Cytb分子標記由于進化速率適中，已經廣泛應用于柔魚種群內、種群間遺傳研究，進行遺傳多樣性分析［24－26］。其中根據Cytb核苷酸的分歧速率，常常被用來估算種群的歷史擴張事件［27］。基于Cytb分子標記分析發現，鳶烏賊兩個地理群體（東印度洋赤道、南海）均具有較高的單倍型多樣性（h＝0.981）和核苷酸 多 樣 性（π＝0.273 32），說明兩個群體遺傳多樣性較高，遺傳資源豐富，這可能與鳶烏賊生命周期短、生長速度快、產卵周期較長且孵化期貫穿全年等生活史特性有關［28］。兩個地理群體核苷酸多樣性存在顯著差異，南海群體（π＝0.277 18）和（k＝200.001）遠高于東印度洋群體（π＝0.007 57）和（k＝5.612），反映出每條序列間堿基組成差異巨大，極有可能是南海海域群體組成不單一，中型群和微型群多個種群交叉存在。

東印度洋三面皆是陸地，南部則是開闊的海洋，因此形成了很多獨特性質，主要表現在它具有季風海洋的特點，在季風影響下，洋流系統復雜多變。在印度洋季風轉換期春季和秋季（4—5月、10—11月），印度洋赤道海域附近會出現一支自西向東的強流-赤道急流（Wyrtki），也有報道稱其核心位置在赤道偏南［18］，影響深度在50 m左右。與此同時，赤道以南有一支自東向西的洋流-南赤道流，以及東西兩個邊界流，共同組成了一個順時針的閉合環流。在印度洋夏季和冬季（6—9月、12—3月），赤道附近的赤道急流消失，夏季赤道北部的莫桑比克海流與赤道以南的南赤道流、以及東西兩個邊界流，構成一個環流系統。冬季，赤道以北的西北向東北季風流，和赤道偏南的南赤道流被赤道附近東向的南赤道逆流分隔開［29］（圖4）。南海海域地處熱帶西太平洋的邊緣地帶，與其他大洋相比，是一個半封閉性的海域，因此也具備了某些大洋的特征，也是一個典型的季風海洋［30］。南海海域群體S4主要受到南海暖流和廣東沿岸流影響［31］，S3群體所處海域受季風影響，容易形成渦流（圖5）。基于東印度洋復雜的海流變化，導致赤道南北群體之間產生一定的遺傳分化，特別是冬季的南赤道逆流則把赤道兩側阻隔。而在夏季，北部的莫桑比克海流則有可能穿過S1群體進入馬六甲海峽，從而有可能與南海海域群體發生基因交流。這也很好地解釋了本研究中鳶烏賊群體組成不是單一群體的原因。

圖4 熱帶東印度洋海流圖（此圖參照WU等［33］的圖13）Fig.4 Tropical East Indian Ocean current chart（This figure refers to figure 13 in WU et al［33］）

圖5 南海海流圖（此圖參照何映輝等［30］的圖3）Fig.5 South China Sea current chart（This figure refers to figure 3 in He et al［30］）

基于遺傳距離繪制的鳶烏賊個體系統發育樹顯示，東印度洋北部海域S1群體中的個體2、3、4、6、25與南海海域S3、S4部分個體遺傳距離較小，而東印度洋南部海域S2群體則沒有類似情況，推測東印度洋北部群體S1部分個體可能通過馬六甲海峽與南海海域部分個體有一定的基因交流，而印度洋南部海域受赤道逆流影響，從而與南海海域群體交流困難。這也與鳶烏賊分布廣泛以及有較強的游泳能力相關［1］。S3和S4個體互相交織，但是形成兩個支系，也印證了表3中k值和π值的異常數據。

兩兩群體的Fst顯示，東印度洋北部群體S1與南部群體S2之間Fst＝0.085 88、南海南部群體S3 Fst＝0.549 90、南海北部群體S4 Fst＝0.709 65，顯示兩個地理群體之間的遺傳差異顯著，但是S1與S3之間的Fst小于S1與S4的，與遺傳距離顯示的結果一致。南海海域兩個群體（Fst＝0.025 36），沒有遺傳差異，但是有一定的遺傳距離（0.597），且圖3中，南海兩個采樣群分化為兩個支系，但是均包含兩個群體的樣本，這也印證了南海海域種群結構復雜，與李敏等［16］研究該海域種群高度重合、但是種間遺傳差異顯著的結果相一致。圖4中S3、S4有明顯的雙峰，極有可能是每個采樣群包含了有遺傳差異的連個群體，每個群體對應一個峰。總體而言，東印度洋赤道北部群體S1和南部群體S2之間遺傳距離要遠遠小于東印度洋與南海之間的遺傳距離，說明地理隔離影響效應可能要遠遠超過洋流對其的影響。

大洋性柔魚的群體遺傳學研究主要依賴于形態學標記，劃分不同種群結構的有效方法之一是依據其外部形態特征來進行判斷［32］。但是，種群結構的差異往往與性別、年齡、產卵季節、性成熟胴長等諸多因素有關，穩定性不高［33］。因此，形態學與分子標記相結合，一起對其群體進行遺傳變異分析會更為準確。今后有必要增加形態學數據對分子標記結果加以佐證。同時，增加馬六甲海峽海域的鳶烏賊樣本能更好地證明以上的結果。

3.2 系統發育地理格局和群體歷史動態

系統發育地理格局和群體歷史動態隸屬于分析系統地理學，其針對種群歷史性的進化特征進行推論，得出相應的結論［27］。基于S2鳶烏賊種群Cytb單倍型核苷酸不配對分布的τ值為2.429，計算可得S2鳶烏賊種群發生種群擴張事件的時間在7.3萬年前—6.1萬年前，處于末次冰期（7.5萬年前—1萬年前）［34］。在過去100萬年間，地球經歷了一系列周期為10萬年的冰期-間冰期變化，伴隨著每次冰期，海平面下降的峰值可達120～140 m［35］，冰期的溫度要比間冰期低3～4℃［36］。全球氣候變化以及海洋環境因子的變化對眾多海洋生物的空間結構分布產生了深遠影響，從而形成了當今格局。

4 小結

本研究通過對東印度洋赤道南北海域、南海南部、北部海域120尾鳶烏賊個體的Cytb基因研究，揭示了東印度洋赤道海域群體和南海海域群體遺傳分化顯著，在漁業管理上應該看作兩個獨立的單元管理，進而更好地保護種群多樣性。而東印度洋赤道兩側群體出現中等程度的遺傳分化，未來可增加馬六甲海峽海域的鳶烏賊樣本以更好地驗證本文的推測。

本研究所用Cytb基因片段只能反映母本的種群遺傳分化特征，而不同的基因片段進化速率及其所展現的系統發育信息存在一定差異，今后有必要整合其他基因片段或基因組DNA數據，更全面地反映種群遺傳結構信息。而且今后可以增加形態學數據信息，結合形態學所反映的種群結構信息，更加深入地了解鳶烏賊的種群遺傳結構。