模擬生態系統中恩諾沙星在沉水植物體內蓄積、代謝和消除規律

李傳步，王 元，趙 姝，范培莉，凌 海，李新蒼，周俊芳，房文紅

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部東海漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，國家水生動物病原庫，上海 201306）

隨著集約化水產養殖日益發展，水產病害愈加嚴重，抗菌藥物被廣泛用于疾病的預防和治療，施用的抗菌藥物大部分隨著水生動物的代謝而進入到養殖水體中［1］。水體中的抗菌藥不僅能通過食物鏈進入人體而危害人類健康，還能誘導微生物產生耐藥基因，并通過水流動介質而傳播擴散［2］。恩諾沙星是獸醫專用抗菌藥，其通過阻斷微生物DNA促旋酶和異構酶Ⅳ抑制細菌增殖而產生殺菌效果，具有廣譜抗菌作用，在水產動物疾病防治上有明顯效果，因此在水產養殖業中被廣泛使用［3］。而該類化合物化學結構穩定，難溶于水，并能在水體中持久存在［4］。

2019年，農業農村部等十部委發布《關于加快推進水產養殖業綠色發展的若干意見》，提出要加強水產養殖獸藥等投入品的合理使用，提倡水產生態養殖，鼓勵利用水生植物對成片養殖池塘和工廠化養殖尾水進行處理，合理利用水資源。目前，關于水產養殖尾水排放標準僅對水體的pH、總氮、總磷、COD等營養鹽指標有所規定，尚未對水體中抗菌藥殘留污染進行要求和規定。

水生植物在處理水體富營養化和重金屬污染中已取得很大的進展［5］。目前，越來越多的學者關注水生植物處理水環境中的抗菌藥污染研究。CARVALHO等［6］在實驗室研究發現，蘆葦（Phragmites australis）可以去除水中的恩諾沙星和四環素；國內也有研究報道沉水植物大薸（Pistia stratiotes）和鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）在水培條件下可以去除水中4種抗菌藥（鹽酸金霉素、氨芐青霉素、鹽酸土霉素和鹽酸四環素）［7］。除了實驗室研究外，也有學者利用水生植物構建人工濕地系統并成功去除了水體中的抗菌藥［8－10］。但是，目前相關研究大多都集中于水生植物對抗菌藥的去除效率和性能上，很少有關于其蓄積、代謝和消除能力的研究。

根據中國濕地分類國家標準，河蟹養殖池塘為一種人工濕地［11］，但關于河蟹池塘沉水植物對抗菌 藥 去 除 的 研 究 甚 少，僅ZHANG等［12］、GOMES等［13］和 朱 利 明［14］分 別 研 究 了 苦 草（Vallisneria natans）、伊樂藻（Elodea nuttallii）對恩諾沙星和苦草對磺胺的吸收能力，以及苦草對水體中磺胺的去除規律。因此本研究以河蟹養殖中典型沉水植物苦草、伊樂藻和輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）為研究對象，以QuEchERS法（一種簡單、快速、安全的樣品凈化方式）為基礎，建立了沉水植物中喹諾酮類抗菌藥的HPLC檢測方法，通過模擬生態實驗比較了幾種沉水植物對恩諾沙星的蓄積、代謝和消除能力，旨在評估沉水植物在養殖尾水處理中的修復作用，同時也為水產生態養殖提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（e2695，美國Waters），熒光檢測器（2475，美國Waters）高速冷凍離心機（CF16RN，日本HITACHI），旋轉蒸發儀（RE-52A，中國重葉），組織勻漿機（T10，德國IKA），多管渦旋混合儀（EFAA-HM-01，中國ANPEL），超聲波清洗機（SB-5200D，中國SCIENTZ），超純水儀（Milli-Q IQ 7000，法國默克）。

1.2 試劑

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）和環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）標 準 品 為 德 國Dr.Ehrenstorfer公司產品；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、氨基、十八烷基鍵合相硅膠（C18），以及色譜純乙腈和甲酸均為CNW產品；乙酸、磷酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀和尿素均為化學純試劑（滬試）。ENR和CIP事先配制成濃度為100 mg·L－1混合標準母液，置于棕色瓶中4℃保存備用。

提取液A：乙腈；提取液B：0.1%甲酸酸化乙腈；提取液C：1%甲酸酸化乙腈；提取液D：1%乙酸酸化乙腈；提取液E：4%乙酸酸化乙腈，后4者均為體積比（V/V）。

1.3 實驗用沉水植物

苦草、伊樂藻和輪葉黑藻采自上海市崇明區惠康水產養殖專業合作社，該合作社無恩諾沙星和環丙沙星使用記錄。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈：0.01 mol·L－1四丁基溴化銨溶液（磷酸調pH至2.80）＝10∶90（V/V），使用前進行抽濾、脫氣；柱溫28℃；流速1.0 mL·min－1；進樣量10μL；熒光檢測波長，激發光波長（Ex）＝280 nm，發射波長（Em）＝450 nm。

1.5 前處理方法的建立

稱取2.00 g待測沉水植物（苦草）樣品，加入10.00 mL提取液，組織勻漿機粉碎5min，振蕩提取15 min，加入1.00 g氯化鈉，振蕩均勻，10 000 r·min－1離心2 min；收集上清液至離心管中，加入50 mg PSA和5 mg GCB，渦旋振蕩1 min，10 000 r·min－1離心2 min；取5.00 mL上清液至雞心瓶中，于40℃旋轉蒸發儀減壓蒸干，加入1.00 mL流動相，渦旋溶解，過0.22μm濾膜上機分析。

1.6 方法學實驗

采用外標法，分別向3種沉水植物（苦草、伊樂藻和輪葉黑藻）樣品中加入ENR和CIP，設3個添加水平（0.05、0.10、0.50μg·g－1），根據1.5所建立的方法，以3倍信噪比、外標法和相對標準偏差分別計算檢測限、回收率和精密度。

1.7 沉水植物蓄積恩諾沙星模擬實驗

實驗共設置3組，分別對應苦草、伊樂藻和輪葉黑藻，每組設4個平行。實驗在55 cm×42 cm×33 cm的高密度聚乙烯箱中進行，箱子底部鋪上厚度5 cm底泥（事先檢測不含ENR和CIP），水位高度20.5 cm；每個箱子種植質量（200±2）g、高（18±2）cm的沉水植物，每周添加1 mL的磷酸二氫鉀（10 g·L－1）和尿素（20 g·L－1）；暫養一周后開始實驗，潑灑恩諾沙星使水體濃度為200μg·L－1，在藥物潑灑后的1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、20 d和25 d采集沉水植物，用純凈水沖洗后置于－20℃冰箱保存。

1.8 數據處理

方法學數據通過Excel進行處理，沉水植物體內的藥動學參數通過DAS 3.1進行計算，生物富集系數FBC＝Cf/Cw，其中，Cf和Cw分別為藥物在生物體內的濃度和水中的濃度。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的建立

2.1.1 提取液的選擇

分別采用乙腈、0.1%甲酸酸化乙腈、1%甲酸酸化乙腈、1%乙酸酸化乙腈和4%乙酸酸化乙腈，按照1.5的處理步驟，對添加ENR和CIP標準品（0.5μg·g－1）的沉水植物（苦草）樣品進行提取，其加標回收率見圖1。隨著乙腈酸化程度的提高，ENR和CIP的回收率也相應提高，但雜質也隨之增多，干擾加大，精密度下降。因此，選擇提取液C（1%甲酸酸化乙腈）作為沉水植物中ENR和CIP的提取液。

圖1 不同提取液下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.1 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes under different extraction conditions（n＝3）

2.1.2 萃取鹽的選擇

為了降低待測物在水相中的溶解度，使有機相和水相分層，設計了0.5 g NaCl、1.0 g NaCl、2.0 g NaCl、0.5 g無水Na2SO4、1.0 g無水Na2SO4和2.0 g無水Na2SO46組實驗，結果表明，2種脫水鹽對恩諾沙星回收率影響不大，對環丙沙星回收率略有影響，Na2SO4組的重復性沒有NaCl穩定。從回收率、重現性來看，1.0 g NaCl組效果最優。

圖2 不同脫水鹽下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.2 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes with different extraction salts（n＝3）

2.1.3 提取時間的選擇

沉水植物勻漿在提取液中的渦旋時間長短對ENR和CIP回收率的影響結果見圖3。提取效果主要由提取液和樣品接觸的提取時間所決定，渦旋提取15 min，ENR和CIP回收率最高，渦旋時間再延長未見回收率提高。

圖3 不同提取時間下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.3 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes with different extraction time（n＝3）

2.1.4 樣品凈化條件的優化

沉水植物水分含量高、色素含量高、基質復雜，采用QuEChERS法常用的凈化劑PSA、GCB、氨基和C18去除樣品中碳水化合物、脂肪酸和色素等極性物質［15］。實驗設計了不同含量PSA（50 mg、100 mg和150 mg）、GCB（5 mg、10 mg和15 mg）、氨基（50 mg、100 mg和150 mg）和C18（50 mg、100 mg和150 mg）對沉水植物中恩諾沙星和環丙沙星回收率的影響（圖4），結果表明，PSA和GCB的回收率及其重現性優于氨基和C18，50 mg的PSA和5 mg的GCB即可達到較高的回收率。進一步實驗表明，兩者同時使用，基線更加平穩，雜質干擾少。

圖4 不同凈化劑下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.4 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes cleaned by different purification agents（n＝3）

2.2 方法學建立

2.2.1 沉水植物中ENR和CIP色譜行為

圖5是ENR和CIP標準品、沉水植物空白樣和加標樣的HPLC色譜行為圖。ENR和CIP的保留時間分別為4.25 min和3.35 min，基線平穩，藥物峰分離良好，成BB峰，滿足藥物分析要求。

圖5 0.5μg·mL－1 ENR和CIP標準品、沉水植物空白和沉水植物加標色譜圖Fig.5 Chromatograms of 0.5μg·mL－1 ENR and CIP standard，blank submerged macrophyte and submerged macrophyte added standards

2.2.2 標準曲線和檢測限

將恩諾沙星和環丙沙星混標母液（濃度分別為100 mg·L－1）稀釋成1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01 m·L－1的標準品濃度進行HPLC分析，以藥物峰面積（y）對應藥物質量濃度（x）進行線性回歸分析，ENR和CIP的標準曲線和檢測限見表1。

表1 ENR和CIP的線性關系、相關系數和檢測限Tab.1 Linear relationship，correlation coefficient and detection limit of ENR and CIP

2.2.3 回收率與精密度

在空白沉水植物（苦草、伊樂藻和輪葉黑藻）樣品中設置ENR和CIP 3個添加水平（0.05、0.10、0.50μg·g－1），按優化后的方法測定回收率。結果顯示，在3種沉水植物中ENR平均回收率為79.60%～104.90%，相對標準偏差為0.86%～10.90%；CIP平均回收率為57.26%～102.00%，相對標準偏差為0.80%～11.72%。

2.3 沉水植物對恩諾沙星的蓄積、代謝與消除

2.3.1 沉水植物對恩諾沙星的蓄積與消除規律

施藥后，苦草、伊樂藻和輪葉黑藻中恩諾沙星含量隨時間的變化見圖6。沉水植物中恩諾沙星含量均呈現先快速升高、后下降的趨勢，且均在施藥后24 h達到最高值，分別為0.82μg·g－1、0.86μg·g－1和2.34μg·g－1，之后均呈緩慢下降的趨勢，600 h時恩諾沙星濃度分別降至0.09μg·g－1、0.15μg·g－1和0.22μg·g－1；采用梯形法計算曲線下面積，分別為192.06（μg·g－1）·h、209.92（μg·g－1）·h和471.44（μg·g－1）·h。24 h時沉水植物中恩諾沙星含量最高，此時水樣中恩諾沙星濃度平均為0.084 3μg·g－1，推算3種沉水植物對恩諾沙星的生物富集系數FBC分別為9.7、10.2和27.8。

表2 不同沉水植物的加標回收率和精密度（n＝3）Tab.2 Recovery and precision of different submerged macrophytes（n＝3）

圖6 沉水植物中恩諾沙星含量隨時間變化（n＝4）Fig.6 Profile of enrofloxacin concentrations in submerged macrophytes with time（n＝4）

2.3.2 沉水植物中環丙沙星的消除規律

施藥后，苦草、伊樂藻和輪葉黑藻中恩諾沙星代謝產物環丙沙星含量隨時間的變化見圖7。3種沉水植物中環丙沙星濃度總體趨勢呈先上升后下降的趨勢，且均在施藥后72 h達到最高值，分別為0.027μg·g－1、0.029μg·g－1和0.037 μg·g－1，300 h后呈現緩慢下降趨勢；采用梯形法計算曲線下面積，分別為8.42（μg·g－1）·h、8.21（μg·g－1）·h和12.21（μg·g－1）·h。苦草、伊樂藻和輪葉黑藻中代謝產物環丙沙星最高含量與恩諾沙星最高含量的百分比分別為3.29%、3.37%和1.58%，代謝產物環丙沙星曲線下面積與恩諾沙星的百分比分別為4.39%、3.87%和2.59%。

圖7 沉水植物中環丙沙星含量隨時間變化（n＝4）Fig.7 Profile of ciprofloxacin concentrations in submerged macrophytes with time（n＝4）

3 討論

3.1 沉水植物中喹諾酮類的檢測方法

沉水植物水分和色素含量高，基質復雜，干擾因素大，已有的前處理方法不能很好適用于沉水植物，本實驗從提取液、脫水鹽和吸附劑等幾方面進行了優化。1）恩諾沙星和環丙沙星在酸性條件下溶解較好，在乙腈中添加甲酸或乙酸，使提取環境呈酸性，能有效抑制藥物的離子化，從而提高了待測物在有機相中分配比例。2）QuEChERS法簡便、快捷，常用于農產品藥殘檢測的樣品前處理，但商品化的QuEChERS試劑不適用于沉水植物。QuEChERS法處理生物樣品時，為了降低待測物在水中的溶解度，通常加入NaCl、無水Na2SO4和無水MgSO4等萃取鹽［15］，因為喹諾酮類藥物容易與Mg2＋離子形成穩定的螯合物［16］，本實驗中僅比較了NaCl和無水Na2SO4，從實驗結果來看NaCl提取效果的穩定性優于無水Na2SO4。3）比較了不同凈化劑對喹諾酮類藥物回收率的影響，其中C18對ENR和CIP存在一定的吸收，PSA、氨基和GCB的用量對其幾乎沒有影響，但氨基的穩定性遠低于其他凈化劑，而PSA結構中含有2個NH2，吸附量大于氨基，并且兩個NH2可以螯合樣品中的金屬離子，GCB對蔬菜樣品中的色素具有很好的吸附效果［17］，因此本實驗采用PSA和GCB組合，可以有效解決沉水植物中色素等雜質的干擾。

本方法回收率低于羅潔等［18］和田茂軍等［19］在蔬菜中喹諾酮類的檢測方法，推測其可能的原因是沉水植物在水徑流作用下容易蓄積污染物，雜質干擾多從而導致回收率降低。但本方法通過萃取鹽和凈化劑分別去除水分和雜質，降低濃縮時間和節約成本，更有利于檢測工作。

3.2 水生植物在去除水環境化學污染物中作用

水生植物是人工濕地和水產養殖尾水處理系統中的基本組成部分。水生植物不僅直接吸收水中的營養鹽供其自身生長，并且能富集水中的農藥、抗菌藥和重金屬等污染物，通過直接吸收、根系分泌作用和根區微生物作用，直接或間接去除化學污染物［20］。有研究報道，人工濕地中，磺胺甲■唑、羅紅霉素和氧氟沙星3種抗菌藥在種植風車草（Cyperus involucratus）條件下的去除率均高于未種植水生植物的去除率［21］。FERNANDES等［22］在實驗室條件下確定了蘆葦能吸收并降解恩諾沙星；ZHANG等［12］在模擬池塘環境中發現歐亞苦草（Vallisneria spiralis）能有效去除底泥中的恩諾沙星和環丙沙星，但沒有明確是水生植物的吸收降解，還是光降解、水解作用，或是底泥微生物的作用。本實驗比較了3種水生植物對恩諾沙星的蓄積作用，發現輪葉黑藻對水環境中恩諾沙星富集遠大于其他兩種沉水植物，說明研究藥物在植物體內的代謝、蓄積和消除規律是明確植物作用的重要手段。

3.3 恩諾沙星在水生植物中的代謝

關于恩諾沙星代謝產物的研究在真菌、哺乳動物、家禽類動物和水生動物中報道很多，但對于水生植物中恩諾沙星代謝產物的研究，僅在歐亞苦草（Vallisneria spiralis）［12］、加拿大伊 樂 藻（Elodea canadensis）［13］、反 枝 莧（Amaranthus retroflexus）［23］、大車前（Plantago major）［23］、小酸模（Rumex acetosella）［23］和 滿 江 紅（Azolla filiculoides）［23］等植物中提及能將恩諾沙星代謝成環丙沙星，本研究結果與其相一致，在苦草、伊樂藻和輪葉黑藻都能檢測到代謝產物環丙沙星的存在，從代謝產物環丙沙星最高含量和曲線下面積來看，與恩諾沙星在水生動物中較為接近［23－24］。GOMES等［13］提出了細胞色素P450很可能參與了水蕰草中恩諾沙星代謝生成環丙沙星的過程，目前關于水生植物中恩諾沙星代謝的研究僅局限于檢出環丙沙星，恩諾沙星在水生植物中的代謝機制還需今后進一步深入研究。