微小RNA-203預測胃癌肝轉移及預后的臨床價值

姜孝奎，李振想，孟鑫，李韶山

胃癌（gastric cancer，GC）是一種高發病率和高死亡率的惡性腫瘤，被列為癌癥相關死亡的第二大誘因，并在全球造成較大的健康負擔［1］。盡管在GC的治療上已經取得了較大的進步，但由于頻繁復發和遠處轉移使GC病人的預后仍令人沮喪，肝臟是晚期胃癌血行轉移的常見部位［2-3］。為了克服這些臨床問題，顯然需要識別早期復發或預后不良的生物標志物［4］。miR-203對胃癌轉移和臨床預后的評估價值還未有研究，本研究通過細胞實驗證實miR-203為外泌型miRNA，檢測病人外周血中miR-203的水平，分析不同病理特征間的表達差異及對胃癌肝轉移和術后3年死亡的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月至2017年12月在新鄉醫學院第三附屬醫院接受手術治療的胃癌病人115例，男74例，女41例，年齡（56.7±11.3）歲，范圍為32～75歲。納入標準：①術后經病理學診斷為胃癌；②原發性胃癌；③術前未經過放化療。排除標準：①有傳染性疾病、自身免疫病或其他腫瘤；②術后未完成放化療；③失訪病人。同時收集健康志愿者40例為非胃癌病人組，男23例，女17例，年齡（54.7±12.6）歲，范圍為34～70歲。

1.2 臨床資料收集及術后隨訪收集病人的一般臨床資料，主要包括：性別、年齡、原發腫瘤（T）分期、淋巴結（N）分期、遠處轉移（M）分期、原發腫瘤、淋巴結、遠處轉移（TNM）分期、胃癌肝轉移、腹膜轉移、腫瘤長徑、術后3年存活情況。以門診和電話相結合的方式進行術后隨訪，最短隨訪時間14個月，最長隨訪時間36個月。

1.3 qRT-PCR檢測外周血中miR-203 的表達水平收集病人外周血5 mL，以3 000 r/min的速度離心15 min，留取上清放置-80℃冰箱中待用。TRIzol法提取細胞總RNA，使用miRNA分離試劑盒從血清和培養基樣品中提取miRNA，經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0時視為合格品，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：40℃、40 min，30℃、10 min。以cDNA為模板。引物序列：miR-203正 向 引 物 序 列 為5′-CTTGCTACTTCATTCAACCAC-3′、反 向 引 物 序 列 為5′-AGTTTGACGTTAGTCCAA-3′，U6正向引物序列為5′-CTGCGTAATCCTCTGCCTAT-3′、反向引物序列為5′-GTCCCACCGTGTGGTAACCG-3′。PCR反應體系共25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水9.5 μL。反應條件：95℃、20 s，95℃、10 s、60℃、20 s共40個循環，最后70℃、10 s。反應結束，統計每樣本循環閾值（CT）。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-203相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0軟件，計量資料行正態性檢測，符合正態分布的資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，單因素和多因素logistic回歸分析和Cox回歸分析檢測影響胃癌肝轉移和胃癌術后3年內死亡的危險因素，ROC分析miR-203對胃癌肝轉移和胃癌術后3年內死亡的預測價值。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌病人外周血中miR-203 的表達水平與病人臨床病例特征的關系胃癌病人外周血中miR-203的表達水平為0.482±0.107，低于非胃癌病人外周血中的水平1.529±0.154（t=8.20，P＜0.001）。胃癌病人的N分期、M分期、TNM分期、肝轉移、腹膜轉移、術后3年存活情況與miR-203的表達水平有關（P＜0.05），見表1。

表1 胃癌115例外周血中miR-203的表達水平與臨床病例特征的關系/

表1 胃癌115例外周血中miR-203的表達水平與臨床病例特征的關系/

病例特征年齡＜60歲≥60歲性別男女T分期T1/T2 T3/T4 N分期N0 N1/N2/N3 M分期M0 M1 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ肝轉移陰性陽性腹膜轉移陰性陽性腫瘤長徑＜3 cm≥3 cm術后3年存活情況存活死亡例數60 55 74 41 37 78 67 48 84 31 58 57 90 25 103 12 81 34 93 22 miR-203水平0.504±0.185 0.402±0.143 0.471±0.114 0.435±0.107 0.481±0.154 0.425±0.130 0.691±0.251 0.215±0.117 0.652±0.273 0.254±0.105 0.745±0.214 0.235±0.084 0.705±0.087 0.201±0.207 0.734±0.063 0.172±0.102 0.487±0.124 0.419±0.082 0.594±0.110 0.312±0.104 t值1.95 1.02 0.95 5.30 5.02 6.34 6.32 6.82 1.35 4.32 P值0.098 0.132 0.541＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.105＜0.001

2.2 logistic回歸分析影響胃癌肝轉移的因素以胃癌是否發生肝轉移為自變量，將表1中的因素和miR-203水平代入logistic單因素回歸模型中，結果顯示T分期、N分期、M分期、TNM分期和miR-203對胃癌肝轉移有影響，將對胃癌肝轉移有影響的因素代入logistic多因素回歸模型中，結果顯示N分期、M分期、TNM分期和miR-203為影響胃癌術后肝轉移的獨立危險因素，見表2。

表2 胃癌115例術后肝轉移單因素和多因素logistic回歸分析

2.3 Cox回歸分析影響胃癌術后3年死亡的因素以胃癌術后3年內是否死亡為自變量，將表1中的因素和miR-203水平代入Cox單因素回歸模型中，結果顯示N分期、M分期、TNM分期、肝轉移、腹膜轉移和miR-203對胃癌術后3年內死亡有影響，將對胃癌術后3年內死亡有影響的因素代入Cox多因素回歸模型中，結果顯示N分期、M分期、TNM分期、肝轉移、腹膜轉移和miR-203為影響胃癌術后3年內死亡的獨立危險因素，見表3。

表3 胃癌115例術后3年死亡單因素和多因素Cox回歸分析

2.4 外周血中miR-203 預測胃癌肝轉移、胃癌術后預后不良的臨床價值外周血中miR-203預測胃癌術后肝轉移的曲線下面積（95%CI）為0.91（0.86，0.92），特異度為81.4%，靈敏度為80.3%。預測胃癌術后3年內病人死亡的曲線下面積（95%CI）為0.85（0.81，0.89），特異度為72.4%，靈敏度為89.3%。

3 討論

胃癌是一種致命的惡性腫瘤，臨床治療面臨巨大挑戰［5-6］。盡管人們對遺傳和表觀遺傳學的癌癥事件的了解越來越多，但缺乏早期評估GC轉移和預后的非侵入性方法或生物標記物。非編碼RNA特別是miRNA進入“癌癥領域”已有10多年的歷史，miRNA是內源性的小非編碼RNA分子，長度為19-22個核苷酸［7］。超過50%的人類miRNA位于脆弱位點，這些位點與癌癥的發生和發展有關［8-9］。多項研究顯示，胃癌組織中多種miRNA表達失調，更重要的是有些可以在體循環中被檢測到。循環系統中miRNA水平的改變可能與GC病人的生理和病理改變直接相關［10-12］。

MiR-203是公認的抑癌基因，也是啟動子甲基化過度的靶標，已被證實可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和腫瘤血管生成［13-15］。盡管miR-203在GC中已有報道，對miR-203的上皮間質轉化和侵襲有影響，但未有研究探討其作為血清生物標志物的可行性［16］。本研究外周血中miR-203表達水平與N分期、M分期、TNM分期、肝轉移、腹膜轉移、術后3年存活情況有關，此結果與以往的研究結果有相似之處［17-18］。本研究顯示在肝轉移、淋巴結轉移、腹膜轉移和遠處轉移的病人血清miR-203水平均較低，說明miR-203水平降低有利于轉移。MiR-203發揮腫瘤抑制作用［19-20］，可能在GC細胞中被下調，因此GC細胞不能在細胞外環境中產生足量的miR-203，導致其在外周血中的水平降低。以上結果表明，發生肝轉移和胃癌術后3年內死亡的病人外周血中可檢測到低水平的miR-203，臨床對外周血中miR-203監測，對預測GC轉移和術后的存活可能具有一定的臨床價值。同時回歸分析顯示，miR-203為胃癌肝轉移和胃癌術后3年內死亡的獨立危險因素，miR-203對胃癌肝轉移和胃癌術后3年內死亡具有一定的預測價值。

綜上所述，miR-203在胃癌外周血中的表達水平降低對胃癌肝轉移和胃癌術后3年內死亡具有一定的預測價值。