棒柄花葉提取物對肝纖維化大鼠的防治作用及其機制*

張夢師，黃奕璇，李潔蓮，易敏銘，肖 敏，郭 超，黃春英△，楊 斌△

（1.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021；2.玉林市中醫院肝病科，玉林 537000；廣西醫科大學第八附屬醫院，貴港 537100）

全球每年有200 萬人死于肝臟疾病，因肝硬化和肝癌死亡的人數占疾病總死亡人數的3.5%[1]。肝纖維化是多種慢性肝病發展成為肝硬化甚至肝癌的必經病理環節。若能及時醫治，將有助于減輕肝硬化和肝癌的發生。棒柄花葉為大戟科植物棒柄花Cleidion brevipetiolatumPax et Hoffm 的干燥枝葉。為廣西壯藥，民間用于治療黃疸、急慢性肝炎、痢疾、熱淋等[2]。研究表明棒柄花方可明顯改善肝炎患者肝功能、降低患者膽紅素，對肝炎肝膽濕熱證患者的臨床癥候有好轉作用，并發現棒柄花可改善肝功能、表征等各項指標[3-4]。本研究使用棒柄花葉水提物干預肝纖維化大鼠，旨在探究棒柄花葉水提物對肝纖維化的干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD 大鼠60 只，SPF 級，體重（180±20）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供（實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2020-0004；實驗動物生產許可證號：SCXK（桂）2020-0003）。動物實驗方案經廣西醫科大學實驗動物中心動物倫理委員會審核批準。

1.2 主要藥品與試劑 棒柄花葉水提物，由廣西玉林市中醫醫院鑒定并提供，濃度：1.55 g（生藥量）/mL。秋水仙堿片，西雙版納藥業有限責任公司，0.5 mg×20 片，批號：20 190422；生理鹽水，貴州天地藥業有限公司，批號：D19 092901；四氯化碳（CCl4），成都市科龍化工試劑廠，批號：20 190605；花生油，山東魯花集團有限公司，批號：20 190504；腫瘤壞死因子-α（TNF-α），江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201912；三型膠原（COL-Ⅲ），武漢華美生物科技有限公司，批號：N20 019515；四型膠原（COL-Ⅳ），武漢華美生物科技有限公司，批號：N16 019516；分子生物級超純水，HyClone，批號：SH30538.02；反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒，Thermo，K1622。

1.3 模型建立與給藥[5]SPF級SD雄性大鼠60只，適應性飼養1 周后，將其隨機分為6 組：正常對照組，模型對照組，秋水仙堿組和棒柄花葉水提物高、中、低劑量組。除正常對照組外，各組大鼠灌胃50%CCl4花生油溶液1 mL/kg，每周2次，連續6周。造模同時，秋水仙堿組灌胃0.2 mg/kg的秋水仙堿溶液，棒柄花葉水提物高、中、低劑量藥物組分別灌胃4.8 g/kg、2.4 g/kg、1.2 g/kg 的棒柄花葉水提物，模型對照組灌胃蒸餾水，1 次/d。為精確的給藥量，每次給藥前均進行稱重。

1.4 給藥劑量 棒柄花人臨床擬用劑量12 g/d（生藥量），參照《藥理實驗方法學》的傳統經典的等效劑量直接折算法。換算出大鼠給藥低劑量、中劑量、高劑量分別為1.2 g/kg、2.4 g/kg、4.8 g/kg（生藥量/體重）。

1.5 肝臟系數檢測及肝組織病理學檢查 處死大鼠后；取出胸腺、肝臟，精密電子天平稱取胸腺、肝臟重量，計算臟器系數；取每一只大鼠肝大葉的同一位置約1 cm×1 cm 大小，用10%福爾馬林溶液固定，用于蘇木精—伊紅（HE）染色和Masson 染色病理學檢查。

1.6 肝功能、膠原指標檢測 6周給藥結束后，大鼠12 h 禁食不禁水。水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 500 r/min 離心30 min 取血清。全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）的含量，根據ELISA操作說明書，檢測血清中COL-Ⅲ、COL-Ⅳ的表達水平。

1.7 炎癥指標檢測 取“1.6 項”下的血清，根據ELISA說明書操作，分別加入抗體和顯色劑，終止顯色反應后15 min 內檢測吸光度，計算TNF-α、白細胞介素（IL）-1的表達水平。

1.8 RT-PCR 測定大鼠肝組織PDGF、FAK、AktmRNA的表達 取各組大鼠肝臟組織100 mg，提取RNA 并進行反轉錄，分別檢測PDGF、FAK、AktmRNA 水平，程序設置：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共40 次循環。相關引物序列如下：PDGF上游引物序列為5’-AGACCTCGTGGGCTTCAGTTAC-3’，下游引物序列為5’-AGGTGGTGTAGAGGCTGTTGAAG-3’；FAK上游引物序列為5’-AAAGCAGTAATGAGCCAACCAC-3’，下游引物序列為5’-TGAGGCGAAATCCATAGCAG-3’；Akt上游引物序列為5’-TCTCAGTGGCACAATGTCAGC-3’，下游引物序列為5’-TGGGTGAACCTGACCGGAAG-3’；內參GAPDH上游引物序列為5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’，下游引物序列為5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’。

1.9 統計學方法 采用SPSS 20.0進行統計分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示。當組間數據比較方差齊時，多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；組間數據比較方差不齊時，采用Tamhane’s T2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對肝纖維化大鼠肝臟系數的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠體重減輕，胸腺指數降低，肝臟指數增加（P＜0.01）。與模型對照組比較，棒柄花葉水提物各劑量組和秋水仙堿組體重和胸腺指數具有上升趨勢（P＞0.05）；肝臟指數具有降低的趨勢（P＞0.05），見表1。

表1 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠臟器指數的影響，n=10

表1 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠臟器指數的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01。

2.2 對肝纖維化大鼠血清生化指標的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠的AST、ALT 的含量升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，秋水仙堿組和棒柄花葉水提物高、中劑量組能降低大鼠的AST、ALT的含量（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝功能的影響，n=10

表2 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝功能的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 對肝纖維化大鼠血清膠原的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠的COL-Ⅲ、COL-Ⅳ含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，棒柄花葉水提物高、中劑量組與秋水仙堿組的肝纖維化指標COL-Ⅲ、COL-Ⅳ的含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表3。

表3 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠纖維化指標的影響，n=10

表3 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠纖維化指標的影響，n=10

與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 對肝纖維化大鼠炎癥反應的影響 與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1含量明顯升高（P＜0.01）。與模型對照組相比，棒柄花葉水提物高、中劑量組和秋水仙堿組顯著降低血清中TNF-α、IL-1 的含量（P＜0.05 或P＜0.01），棒柄花水提物低劑量組能降低血清中IL-1的含量（P＜0.05），見表4。

表4 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠炎癥反應的影響，n=10

表4 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠炎癥反應的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 對肝纖維化大鼠肝組織病理的影響（1）HE染色結果：正常對照組，肝小葉結構正常，中央靜脈和肝索呈放射狀排列，肝組織未見病變；模型對照組肝小葉正常結構被破壞，肝細胞嚴重腫脹，排列紊亂，肝組織內有廣泛的脂肪變性，伴有纖維組織增生和部分組織壞死；秋水仙堿組和棒柄花葉水提物高、中、低劑量組可見減輕肝細胞組織損傷，見圖1；（2）Masson染色結果：正常對照組肝小葉內、匯管區見少量纖維組織。模型對照組肝小葉和匯管區結構破壞，并且有大量的纖維組織增生，有較多的炎性細胞浸潤。秋水仙堿組及棒柄花葉水提物高、中、低劑量組可見肝組織中纖維增生有減少，棒柄花葉水提物對肝纖維組織增生的情況有改善作用，見圖2。

圖1 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝組織病理影響（HE染色，×200）

圖2 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝組織病理影響（Masson 染色，×100）

2.6 對肝纖維化大鼠PDGF-FAK/Akt信號通路的影響 與正常對照組相比，模型對照組顯著上調肝組織中PDGF、FAK、AktmRNA 表達水平（P＜0.01）；與模型對照組相比，秋水仙堿組及棒柄花葉水提物高、中劑量組的肝組織PDGF、FAK、AktmRNA表達水平降低（P＜0.01），見表5。

表5 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠PDGF-FAK/Akt信號通路的影響，n=10

表5 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠PDGF-FAK/Akt信號通路的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種致病因素的損傷進行修復時，引起以膠原蛋白為主的細胞外基質（extracellular matrix,ECM）合成與降解失衡，導致肝內纖維結締組織異常堆積的病理過程。肝纖維化的發展過程是由多種細胞、細胞因子、信號通路等參與、相互作用、相互調控的結果。盡管肝纖維化的發生機制尚不明確，但目前認為其發病可能與以下幾種因素有關：免疫炎癥反應、肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化（中心環節）、細胞因子及其信號途徑和細胞外基質的合成增多降解減少等。

ALT 存在于細胞胞質，AST 存在于細胞器中，當肝細胞損傷，肝細胞膜通透性改變，ALT、AST 會大量進入到血液，血清中AST、ALT 被廣泛應用于判斷肝損傷的敏感和重要的指標[6-7]。Ⅲ、Ⅳ型膠原是構成基底膜膠原的主要成分[8]，正常情況下Ⅲ、Ⅳ膠原的合成和降解是一個平衡的狀態，當肝臟發生纖維化時，肝星狀細胞大量合成，降解下降，血清Ⅲ、Ⅳ膠原含量水平顯著上升。本研究結果顯示，相對于模型對照組的大鼠，灌胃給予棒柄花葉水提物，大鼠的肝損傷指標AST、ALT 活性降低和肝纖維化指標Ⅲ膠原、Ⅳ膠原含量降低。組織病理學結果表明，棒柄花葉水提物可以顯著改變肝細胞松弛及脂肪變性，減少肝細胞的炎癥、壞死以及假小葉形成，減輕肝纖維化增生程度。表明棒柄花葉水提物對CCl4誘導的肝纖維化損傷具有較好的改善作用。炎癥損傷是諸多病因引起肝損傷向肝纖維化發展的中間環節[9-13]。肝細胞損傷導致大量炎癥因子的釋放，炎癥加劇機體損傷，進一步促進肝臟膠原合成、積累。IL-1是機體內一種促炎因子，TNF-α是機體內炎癥反應重要的介質[13]。本研究結果顯示，給予不同劑量棒柄花水葉水提物處理后，肝纖維化大鼠血清中IL-1、TNF-α 的含量有不同程度降低，提示棒柄花葉水提物可能通過減輕炎癥損傷進而影響肝纖維化的發生。

PDGF是重要的有絲分裂源[14-15]，是目前發現最強的HSC 活化激活因子之一，大量研究證實它能通過多種信號途徑促進HSC 的增殖、膠原纖維形成[16]。FAK-Akt就是其中一條信號通路。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，具有酪氨酸蛋白激酶活性，作為整合素蛋白的下游信號分子，FAK蛋白的N端可以和整合素分子的胞質端結合，將整合素信號傳遞至細胞內，調節細胞的增殖、黏附等生物學作用。姜慧卿[17]研究發現FAK 可激活HSCs 的活化，致纖維化發生。白瑞丹等[18]、張坤[19]研究發現抑制FAK 的表達，可以抑制LX-2 細胞的增殖，促進凋亡，進而減輕肝纖維化程度。Akt 為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B，是FAK 信號通路中的下游細胞因子之一。其可通過磷酸化機體內含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物，激活mTOR 和p70S6K 等多種激酶而發揮它的促進增殖、抑制凋亡等各種生物學效應[20]。研究發現在慢性肝纖維化患者中Akt 表達水平升高，抑制Akt的活性可抑制HSCs的增殖，增加HSCs凋亡，對Akt 活化抑制可抑制肝纖維化信號路徑[21-22]。本實驗結果顯示，與模型對照組比較，棒柄花葉水提物高、中劑量組均能下調PDGF、FAK、AktmRNA的表達，表明棒柄花葉水提物抗肝纖維化的作用機制可能與調控PDGF-FAK/Akt信號通路有關。

本實驗表明棒柄花葉水提物可能通過抑制肝臟膠原纖維生成、減輕肝臟炎癥刺激、抑制PDGFFAK/Akt信號通路來逆轉大鼠的肝功能和肝纖維化。本研究為進一步探索棒柄花葉治療肝纖維化的潛在作用機制和對棒柄花葉的進一步制劑開發提供研究基礎。