達格列凈對阿霉素所致心肌損傷保護機制的初步研究*

付 勇，俸艷英

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院心肺功能中心，南寧 530021）

阿霉素（doxorubicin，DOX）是第二代蒽環類抗腫瘤藥物，廣泛用于淋巴瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、軟組織肉瘤、肺癌等血液系統惡性腫瘤和實體瘤的治療[1]。然而，DOX 可誘發心臟毒性導致心肌病和心力衰竭，并且心肌病和心力衰竭是限制DOX臨床應用的最主要不良反應之一[2]。雖然當前許多學者仍致力于防治DOX 誘導心臟毒性的新藥研究[3-4]。但迄今為止，仍然缺乏預防和管理DOX誘發心臟毒性的最佳策略。因此，尋找有效防治DOX心臟毒性的藥物對改善腫瘤患者化療后生活質量具有重要臨床意義。

達格列凈（dapagliflozin，Dapa）屬于鈉—葡萄糖共轉運蛋白2（sodium-glucose transporter 2，SGLT2）抑制劑類非胰島素依賴性降糖藥物。近年來，越來越多的研究表明，SGLT2 抑制劑除降糖作用外，還可顯著降低糖尿病或非糖尿病患者的心力衰竭住院率及心血管疾病死亡風險[5]。有研究發現，Dapa對接受DOX 治療的患者有保護心肌功能的作用[6]。然而，Dapa 心肌保護作用的相關機制尚需要進一步探索。因此，本研究探討Dapa 對DOX 所致心肌損傷的保護作用及可能相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9c2 大鼠心肌細胞株購自中國科學院上海細胞庫。細胞計數試劑盒8（cell counter kit-8，CCK-8）購自日本Dojindo Lab 公司；DOX購自深圳萬樂藥業有限公司；Dapa 購自美國MedChemexpress（MCE）公司；DMEM培養基購自美國Corning公司；特級胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）購自美國Gibco 公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、DAPI染色液購自上海碧云天生物技術有限公司；肌酸激酶（CK）檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；Bax（貨號：2772）、白細胞介素（IL）-6（貨號：12153）、GAPDH（貨號：5174）、HRP 結合二抗（貨號：7074）購自美國CST 公司；Bcl-2（貨號：ab196495）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號：ab6671）購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養

H9c2 大鼠心肌細胞于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，置于含10%FBS 和1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養基，選取對數生長期細胞胰酶消化、傳代進行后續實驗。

1.3 CCK-8法檢測H9c2細胞增殖率并確定藥物最佳作用條件

將H9c2 細胞接種于96 孔板中，每孔3 000 個，設置5 個復孔。待細胞貼壁后，以不加藥處理的H9c2 細胞為NC 組，根據實驗目的進行以下處理：（1）采用濃度為（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）DOX 處理H9c2細胞12 h、24 h，以確定DOX 最佳實驗研究條件；（2）采用濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Dapa 處理H9c2 細胞24 h、48 h，以觀察Dapa 對H9c2 細胞增殖率影響。（3）采用濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L Dapa 預處理細胞24 h，除NC 組外，其余各組加入1 μmol/L DOX 處理24 h，以確定Dapa 最佳預處理條件。終止培養后，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后于培養箱中孵育2 h，用酶標儀（λ=450）記錄各孔吸光度（OD 值）。細胞增殖率計算公式：細胞增殖率（%）=（處理組OD 值-空白孔OD 值）/（NC 組OD 值-空白孔OD 值）×100%。實驗重復3次。

1.4 實驗分組

將H9c2 細胞分為4 組：NC 組（不加藥處理）、DOX 組（用1 μmol/L DOX 處理24 h）、Dapa 組（用1 μmol/L Dapa預處理細胞24 h）、Dapa+DOX組（用1 μmol/L Dapa 預處理細胞24 h，換液后再加用1 μmol/L DOX處理24 h）。

1.5 TUNEL試劑盒檢測H9c2細胞凋亡

H9c2細胞按1.9×105個細胞/孔接種于6孔板中的細胞爬片上，待細胞貼壁恢復正常形態后，按“1.4項”分組處理細胞。各組細胞處理后，4%多聚甲醛固定細胞，用0.3%Triton X-100 通透細胞，TUNEL檢測液于37 ℃避光孵育60 min，DAPI染色5 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組隨機選取3 個視野并計數凋亡細胞數，細胞凋亡率（%）計算公式=每個視野下凋亡細胞數/該視野下細胞總數×100%。實驗重復3次。

1.6 CK試劑盒檢測CK活性

H9c2 細胞按9×105個細胞/孔接種于直徑為100 mm 培養皿中，實驗分組如“1.4 項”所示。處理完成后，取細胞培養液按試劑盒說明書測定CK 活性。實驗重復3次。

1.7 Western blotting檢測心肌促炎因子TNF-α、IL-6和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達水平

取各組H9c2 細胞加入RIPA 裂解液于冰上裂解，離心后取上清液，用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白上樣量30 μg/20 μL，以10%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，電壓80～120 V，電泳1～1.5 h，轉膜后用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉2 h，加入TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000），GAPDH（1∶1 500），4 ℃搖床孵育過夜。TBST 沖洗3 次，每次15 min。加入二抗（HRP 接合IgG，1∶1 500），室溫孵育2 h，配制ECL發光顯影液，于化學發光成像儀上顯影，攝片。用Image J 計算每個蛋白條帶的灰度值，以GAPDH 為內參。實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dapa對DOX誘導H9c2細胞增殖率的影響

如圖1A所示，不同濃度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）DOX 作用H9c2 細胞12 h、24 h 后，細胞增殖率隨DOX 作用濃度和時間增加而降低；與對照組比較，其中1 μmol/L DOX 作用H9c2細胞24 h時，細胞增殖率為[（78.81±4.91）%，P＜0.05]，與本課題組前期實驗模型一致[7]，以該處理濃度和時間作為DOX誘導H9c2心肌細胞模型的處理條件。

如圖1B所示，不同濃度（0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L）Dapa作用H9c2細胞24 h、48 h后，當Dapa濃度為1 μmol/L作用24 h時，細胞增殖率明顯提高（P＜0.05）。如圖1C 所示，與DOX 組H9c2 細胞增殖率比較，Dapa濃度 為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L時可提高H9c2細胞增殖率（P＜0.01），且Dapa濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L時，細胞增殖率之間差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，選擇1 μmol/L Dapa預處理H9c2細胞24 h進行下一步實驗。

圖1 Dapa對DOX誘導H9c2細胞增殖率的影響

2.2 Dapa對DOX誘導H9c2細胞凋亡的影響

如圖2所示，與NC組比較，DOX組細胞凋亡率升高（P＜0.001），Dapa 組細胞凋亡率無顯著差異（P＞0.05）。與DOX 組比較，Dapa+DOX 組細胞凋亡率降低（P＜0.01）。

圖2 Dapa對DOX誘導H9c2細胞凋亡的影響

2.3 Dapa對DOX誘導H9c2細胞損傷的影響

如圖3 所示，與NC 組比較，DOX 組CK 活性升高（P＜0.001）；Dapa 組CK 活性差異無統計學意義（P＞0.05）。與DOX組相比，Dapa+DOX組CK活性下降（P＜0.01）。

圖3 Dapa對DOX誘導H9c2細胞損傷的影響

2.4 Dapa 對DOX 誘導H9c2 細胞炎癥反應和凋亡的影響

如圖4 所示，與NC 組比較，DOX 組H9c2 細胞Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.001），TNF-α、IL-6、Bax蛋白表達水平升高（P＜0.001）；Dapa組TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與DOX 組比較，Dapa+DOX 組H9c2 細胞Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6、Bax蛋白表達水平降低（P＜0.001）。

圖4 Dapa對DOX誘導H9c2細胞炎癥反應和凋亡的影響

3 討論

DOX作為實體瘤和血液系統腫瘤化療的基石，部分患者接受DOX治療后會出現心臟功能受損，且其心臟毒性呈現時間—劑量依賴性[1]，嚴重影響其腫瘤治療中的使用劑量及療效。由于過度氧化應激導致心肌細胞凋亡，是DOX誘導心臟毒性的主要病理機制之一[8]。DOX可直接增加心臟組織中的活性氧生成而激活凋亡調節因子，通過激活內源性凋亡通路誘導BCL-2 凋亡蛋白家族中，促凋亡蛋白Bax的上調[9]和抗凋亡蛋白Bcl-XL下調[10]。Wang等[11]的研究發現，DOX 可引起患者全身性炎癥反應，增強促炎因子TLR4（Toll-like receptor 4）的表達，導致嚴重的心臟毒副作用，同時研究通過阻斷炎癥因子的表達可有效降低DOX 誘導的毒副作用。本研究亦顯示，DOX對心肌細胞的損傷中表現出細胞凋亡率、促炎因子TNF-α、IL-6 和凋亡蛋白Bax 表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低。此外，DOX還可增加炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB的表達[12]，亦可激活NF-κB 信號通路[13]，誘導心肌凋亡。因此，減輕心肌炎癥反應抑制細胞凋亡亦可能是防治DOX所致心臟毒性的作用機制。

Dapa屬于SGLT2抑制劑，作為一種新型非胰島素依賴性降糖藥，在減少心血管不良事件方面的積極作用已經得到證實[14-15]，歐洲心臟病學會最新指南中建議，該藥為心力衰竭或多心血管風險患者優先選用藥物[5]。據報道，SGLT2 抑制劑對接受DOX治療的患者有保留心肌功能作用，推測其可能機制是通過改善心臟能量代謝、預防炎癥、抑制心臟Na+/H+交換器和降低氧化應激[16]。實驗發現，Dapa通過RONS/STAT3 通路調節巨噬細胞M1 型向M2 型轉化，可顯著減輕野生型大鼠心肌梗死后心肌的炎癥反應，減少心肌梗死面積，改善心肌重塑[17]。本實驗研究發現，Dapa預處理后，DOX誘導的H9c2細胞凋亡率降低，促炎因子TNF-α、IL-6和凋亡蛋白Bax表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達升高。表明Dapa 可能通過減輕H9c2 細胞中促炎因子和凋亡蛋白的表達，進而減少細胞凋亡，發揮保護心肌細胞免受DOX毒性損傷作用。

綜上所述，Dapa可能通過降低心肌的炎癥反應和細胞凋亡，對防治DOX誘導心肌細胞毒性起到保護作用。本實驗僅從細胞水平對相關機制進行初步研究，其涉及的信號通路仍需進一步實驗探索。