吲哚胺-2,3-雙加氧酶/犬尿氨酸通路調控糖尿病并發抑郁癥的機制研究*

阿麗婭·吉力力，再努爾·買合木提，盧雪玲△

（新疆醫科大學第七附屬醫院 1.內分泌科；2.全科醫學科，烏魯木齊 830054）

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，可引起糖尿病腎病、視網膜病、心腦血管、抑郁癥等多種并發癥[1]。據統計，全球范圍內糖尿病患病人數已經超過3.5億，預計至2030年將超過5.5億[2]。研究發現，60%～75%糖尿病患者伴有抑郁情緒，其中10%～35%為重度抑郁[3-4]。抑郁癥狀可導致血糖控制不良，增加糖尿病相關并發癥的發生風險，而糖尿病患者血糖控制不佳又會加重抑郁癥狀。因此，探索糖尿病并發抑郁癥的發病機制，尋找有效的治療靶點，對于改善糖尿病患者的生存質量十分重要。

犬尿氨酸（KYN）是一種內源性神經系統興奮性氨基酸受體拮抗劑，在犬尿氨酸-3-單加氧酶作用下可代謝為神經毒性物質3-羥基犬尿氨酸，而3-羥基犬尿氨酸可通過氧化應激損傷、細胞死亡等生物過程造成神經損傷。既往研究表明，KYN代謝途徑（KP）的激活在情緒調節中起著重要作用，是連接神經系統免疫炎性反應等系統與抑郁癥的主要途徑[5]。研究顯示，大鼠血漿中KYN水平降低可以保護大腦免受與抑郁癥相關的應激性變化的影響[6]。提示通過調節細胞因子來降低KYN 水平可達到治療抑郁癥的目的。

吲哚胺-2,3-雙加氧酶（IDO）是一種色氨酸降解酶，也是色氨酸-KP上的第一個限速酶，其可通過裂解色氨酸的吲哚環，使色氨酸代謝為KYN，最終導致色氨酸的相對降低和KYN的積累，從而誘導神經毒性[7]。已有研究證實，IDO/KP通路的激活可能與糖尿病并發抑郁癥有關[8]，但具體作用機制尚未完全闡明。基于此，本研究旨在探討IDO/KP 通路在糖尿病并發抑郁癥大鼠中的調控機制，以期為該病提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠30 只，6～8 周齡，體重（200±20）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（新）2018-0002。在安靜環境下適應性飼養1 周，相對濕度55%～60%，給予充足清潔飲水，自由攝食。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素（STZ）（純度≥98%，規格：100 mg）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；IDO抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）（純度≥96%，規格：250 mg）購自上海易恩化學技術有限公司；KYN對照品（純度≥98%，規格：10 mg）購自成都成科匯博科技有限公司；去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-4、IL-10、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自武漢賽培生物科技有限公司；IDO、GAPDH抗體及HRP標記的二抗均購自美國Abcam公司；BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、增強化學發光試劑（ECL）均購自上海碧云天公司；冰醋酸、醋酸鈉、高氯酸均為分析純，購自中國醫藥集團化學試劑有限公司。

SA215型曠場實驗視頻分析系統購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；IX2-UCB型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；Sorvall ST 16R型臺式冷凍離心機、Varioskan Flash 型多功能酶標儀購自美國ThermoFisher 公司；Agilent1200 高效液相色譜儀購自美國安捷倫公司。

1.3 動物分組、造模及給藥 將30 只大鼠隨機分為對照組、模型組、干預組，每組10只。模型組和干預組復制糖尿病抑郁大鼠模型[9]。采用高脂飼料+注射STZ 的方法建立糖尿病模型：高脂飼料喂養4 周后禁食、不禁水12 h，一次性腹腔注射1% STZ溶液（20 mg/kg），10 min 內注射完畢，血糖＞16.7 mmol/L 視為造模成功。糖尿病模型成功后每日給予無規律的應激處理，包括冷水游泳和束縛，即冷水游泳10 min/d或束縛20 min/d，每天一種刺激，連續刺激4周。以曠場實驗結果作為糖尿病抑郁模型成功的判定標準：大鼠水平運動得分及垂直豎立得分較造模前明顯下降。對照組大鼠注射等量生理鹽水后正常飼養。

于造模成功后第8天起，干預組灌胃給予1-MT溶液（用0.9%NaCl溶解配制成10 mg/mL濃度的溶液）100 mg/kg，1 次/d，連續14 d。對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.4 曠場實驗評估大鼠行為學改變 準備80 cm×80 cm×40 cm的敞箱，將其底面劃分成25個16 cm×16 cm 的方格，實驗時將大鼠從同一位置放于敞箱底面，大鼠適應1 min 后，觀察并記錄大鼠3 min 內水平運動格數（每次四爪皆進入記為1次1分）和垂直豎立次數（每次兩前爪騰空或攀附箱壁記為1次1分）。每次測評結束后，用消毒液擦拭敞箱底面，晾干等待下次使用。水平運動得分及垂直豎立得分越低，表示大鼠抑郁程度越嚴重。

1.5 大鼠海馬組織NE、5-HT及血清炎性因子水平測定 實驗結束后，用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取尾靜脈血2 mL，隨后將大鼠麻醉處死，迅速剝離腦組織，冰上無菌分離出海馬組織。血液離心，取上層血清；取適量海馬組織制成勻漿液，采用ELISA法檢測大鼠海馬組織中NE、5-HT水平及TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平。

1.6 高效液相色譜—熒光法測定大鼠血清KYN水平 取200 μL血清置于EP管內，加入5%高氯酸溶液，混勻；室溫放置10 min 以充分沉淀血清中的蛋白質，10 000 r/min 離心10 min，將上清液轉入另一EP管內再離心10 min；取上清液20 μL，于高效液相色譜儀上進樣分析。流動相為0.125 mol/L醋酸鋅∶乙腈（95∶5）。熒光激發波長340 nm，發射波長450 nm。KYN 采用峰保留值比較法和疊加法定性分析，用外標法測定峰面積進行定量分析。

1.7 Western blotting法檢測大鼠海馬組織IDO 蛋白表達 取海馬組織，RIPA 裂解液提取組織總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜，加入IDO 一抗（1∶1 000）稀釋液4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，洗膜，ECL 發光液顯影，以GAPDH 為內參，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠水平運動行為和垂直豎立行為結果比較 造模第1 周，模型組和干預組大鼠水平運動行為得分和垂直豎立行為得分與對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；造模第4 周，模型組和干預組大鼠水平運動行為得分和垂直豎立行為得分較對照組下降（均P＜0.05），且模型組與干預組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；干預14 d后，模型組大鼠水平運動行為得分和垂直豎立行為得分較對照組下降，且干預組高于模型組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠水平運動行為得分和垂直豎立行為得分比較n=10，分，

表1 各組大鼠水平運動行為得分和垂直豎立行為得分比較n=10，分，

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬組織中NE、5-HT水平比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織NE、5-HT水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，干預組大鼠海馬組織NE、5-HT水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠海馬組織中NE、5-HT水平比較n=10，ng/L，

表2 各組大鼠海馬組織中NE、5-HT水平比較n=10，ng/L，

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平及KYN水平比較與對照組比較，模型組血清TNF-α、IL-6及KYN水平升高，IL-4、IL-10 水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，干預組血清TNF-α、IL-6及KYN水平降低，IL-4、IL-10水平升高（均P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平及KYN水平比較n=10，

表3 各組大鼠血清炎性因子水平及KYN水平比較n=10，

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.4 各組大鼠海馬組織IDO 蛋白表達量比較 與對照組比較，模型組海馬組織IDO蛋白表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，干預組大鼠海馬組織IDO蛋白表達量降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織IDO蛋白表達量比較

3 討論

研究顯示，抑郁癥發生機制可能與神經元細胞的凋亡和增殖、單胺類神經遞質紊亂、線粒體功能障礙、炎癥反應等有關，其中單胺類神經遞質紊亂和炎癥反應與糖尿病并發抑郁癥的機制最為關聯[10-11]。NE 作為一種單胺類神經遞質，在腦中含量降低會導致抑郁癥發生[12]；5-HT 能夠控制神經穩定、調節情緒，從而防止認知和行為障礙。研究表明，5-HT 水平降低與抑郁癥嚴重程度呈負相關關系，監測5-HT水平有助于評估抑郁癥患者病情發展及預后[13-14]。本研究建立糖尿病并發抑郁癥大鼠模型，采用曠場實驗評估大鼠行為學改變，并檢測大鼠海馬組織中NE、5-HT水平，結果發現造模第4周模型組大鼠水平運動得分和垂直豎立行為得分較對照組均顯著下降，且模型組大鼠海馬組織中NE、5-HT 水平均顯著降低。表明本研究糖尿病并發抑郁癥大鼠模型構建成功。

IDO主要存在于淋巴細胞、膠質細胞、樹突狀細胞、微血管內皮細胞及巨噬細胞等細胞中，在免疫反應中發揮重要作用[15-16]。研究發現，抑郁癥小鼠血清中IDO 活性升高，5-HT 活性降低，血清IDO 活性與5-HT水平呈負相關關系[17-18]。通過藥物抑制抑郁癥小鼠體內IDO 活性，可減輕小鼠抑郁樣行為。此外，IDO活性抑制可使小鼠抑郁敏感性降低，神經發生良好。該結果提示IDO 參與了抑郁癥的發生和發展。本研究結果顯示，IDO 抑制劑1-MT 干預后糖尿病并發抑郁癥大鼠水平運動得分和垂直豎立行為得分均顯著升高，同時大鼠海馬組織中NE、5-HT 水平顯著升高。提示抑制IDO 活性可減輕糖尿病并發抑郁癥大鼠抑郁樣行為，提高大鼠海馬組織中單胺類神經遞質水平。

研究發現，炎癥過程與抑郁癥發生的病理生理學有關[19]。促炎因子TNF-α、IL-6 被發現在抑郁患者外周血中水平升高[20]；血清抗炎因子IL-4、IL-10水平越低，抑郁癥患者抑郁發作速度越快[21]。本研究中，糖尿病并發抑郁癥大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高，IL-4、IL-10水平降低；1-MT干預后，大鼠血清炎性因子水平得到明顯改善。表明抑制IDO 活性有助于改善糖尿病并發抑郁癥大鼠體內炎癥反應。

Da 等[8]評估了選擇性5-HT 再攝取抑制劑氟西汀、IDO 直接抑制劑1-MT、IDO 間接抑制劑米諾環素及非選擇性環氧化酶抑制劑布洛芬對糖尿病并發抑郁癥的作用，結果證實上述藥物均可下調糖尿病并發抑郁癥大鼠海馬組織中IDO 表達。本研究發現，糖尿病并發抑郁癥大鼠海馬組織中IDO蛋白表達水平升高，1-MT 干預后大鼠海馬組織中IDO蛋白表達水平降低，與Da等[8]研究結果相符。色氨酸是產生多種具有重要生理作用的神經活性代謝物的底物，其主要分解代謝途徑是KP途徑，由色氨酸生成KYN 是KP 途徑的第一個限速步驟，受IDO等酶的介導[22]。失調的KP 途徑與抑郁癥的病理進程有關，KYN水平升高是抑郁行為的一個致病生物標志物[23-24]。本研究結果顯示，糖尿病并發抑郁癥大鼠血清KYN 水平升高，1-MT 干預后大鼠血清KYN 水平降低。表明抑制IDO 活性能夠降低糖尿病并發抑郁癥大鼠體內KYN水平，從而減少大鼠抑郁行為。

綜上所述，抑制IDO/KP 通路可能通過提高NE和5-HT水平、減輕炎性反應來抑制大鼠糖尿病并發抑郁癥的發生。IDO/KP 通路有望成為糖尿病并發抑郁癥治療的有效靶點。本研究不足之處是未評估糖尿病并發抑郁癥大鼠體內色氨酸濃度以及神經損傷情況，后續將深入探索糖尿病并發抑郁癥中IDO/KP 信號通路上、下游調控因子變化以及IDO活性變化與神經損傷的相關性。