PKA-CREB-BDNF通路在異丙酚誘導大鼠海馬遠期學習記憶功能障礙中的作用研究*

魏艷妮，鄒 敏，余小凡

（重慶市開州區人民醫院麻醉科，重慶 405400）

發育期的大腦非常脆弱，容易受到全身麻醉劑的影響[1]。臨床研究表明，暴露于全身麻醉劑的新生兒和嬰幼兒在青少年時期更容易出現學習和認知功能障礙[2-3]。異丙酚（2，6-二異丙基苯酚）是一種烷基苯酚衍生物，具有起效快和可完全恢復等優點，普遍認為其是理想的靜脈全身麻醉劑，并常規用于兒童麻醉的誘導和維持。然而，研究發現，新生兒暴露于異丙酚會誘導發育中的大腦神經元凋亡和顯著的遠期學習記憶障礙[4]。這些證據引起了人們對小兒異丙酚麻醉安全性的密切關注。蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）在中樞神經系統中普遍表達并介導細胞內信號轉導，其對神經元分化、存活、功能和可塑性以及遠期學習和記憶機制有重要影響[5]。據報道，PKA 抑制劑會損害嚙齒動物的遠期記憶，這意味著PKA 對遠期記憶的形成至關重要[6]。cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）是PKA 的下游靶點，被稱為“記憶開關”，在被蛋白激酶磷酸化后激活，與突觸可塑性和記憶形成有關[7]。且pCREB 級聯反應的上調已得到證實可改善嚙齒動物對行為任務的學習和記憶能力[8]。腦源性神經營養因子（BDNF）是CREB 的下游靶基因之一，既往研究發現，BDNF對CREB的調控具有活性依賴性，其表達參與神經元發育、突觸可塑性和神經保護[9]，在學習和遠期記憶的形成中發揮重要作用[10]。因此，本文旨在研究異丙酚可能通過PKA-CREB-BDNF 信號通路在發育大腦中誘導神經元凋亡，并在成年后引起顯著的學習和記憶障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用SPF級7日齡SD大鼠140只，雌雄各半，體重平均10～12 g，孕鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。新生大鼠與母鼠放置在同一籠內，保持在（25±2）℃和12 h 光—暗周期交替的標準生活條件下（從07:00～19:00 光照），直到出生后第7 天。采用隨機數字表法將7 日齡鼠分為5 組（n=28）：對照組、脂肪乳劑組（10%，10 mL/kg）、異丙酚低劑量組（50 mg/kg）、異丙酚中劑量組（100 mg/kg）和異丙酚高劑量組（200 mg/kg）。

1.2 主要試劑材料

Fluoro-Jade B（FJB）染色試劑盒（Histo-Chem，Jefferson,美國）；小鼠單克隆抗神經元核抗原（NeuN）抗體（Cell Signaling Technology，美國）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天，中國）；抗PKA 抗體（Cell Signaling Technology，美國）；抗pCREB 抗體（Abcam，美國）；抗BDNF 抗體、抗GAPDH 抗體（Santa Cruz，美國）。

1.3 實驗方法

藥物均通過腹腔注射，異丙酚的計量濃度參考已發表研究選擇[11]。對照組大鼠不給予任何處理，脂肪乳劑組給予10%脂肪乳10 mL/kg 劑量腹腔注射，異丙酚組大鼠均每30 min給予50 mg/kg劑量的異丙酚腹腔注射，直至目標累計劑量。翻正反射喪失作為引起無意識和睡眠的指標，秒表記錄翻正反射消失和恢復的時間。麻醉期間，所有幼鼠置于加熱裝置中，直腸溫度保持在（37±1）℃；使用脈搏血氧儀監測氧飽和度，并保持在95%左右。

1.4 動脈血氣分析

麻醉結束后，用32號注射器從左心室獲取動脈血（100 μL），用血氣分析儀進行分析。采血后立即測量動脈氫離子濃度（hydrogen ion concentration，pH）、動脈二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、動脈氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）和動脈氧飽和度（arterial oxygen saturation，SaO2）。該過程在5 min內完成。

1.5 FJB染色檢測變性死亡神經元數目

用10%水合氯醛對大鼠進行深度麻醉，立即取出大腦，4%多聚甲醛固定過夜。將冷凍的腦組織連續切成4 μm厚的冠狀切片。60 ℃玻片加熱器上干燥3～4 h后，在無水乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸餾水（distilled H2O，dH2O）中浸泡，轉入0.06%高錳酸鉀溶液10 min，dH2O 清洗2 min，避光浸入0.001%FJB 溶液30 min。dH2O 清洗3 次，每次1 min，室溫晾干，中性樹脂封固。使用倒置顯微鏡，綠色（450～490 nm）激發光和屏障濾光片，在不同大鼠切片的相似位置獲取CA1區域圖像。

1.6 Morris水迷宮（MWM）實驗

采用MWM 測試系統對65 只大鼠在異丙酚暴露8 周后進行學習記憶測試。將一個裝滿水[深度25 cm，溫度（24±2）℃]的水迷宮水池（直徑160 cm，高50 cm）中加入黑色無毒墨水，使水不透明，水池由2條穿過中心的假想垂直線分為4個相等的象限（I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。第I象限設定為目標象限，1 個可移動的黑色圓形平臺（直徑12 cm）位于中心位置。利用位于水箱中心上方的攝像機和計算機動物追蹤系統監測和轉播圖像。9 周齡時，首先訓練大鼠定位清晰標記的平臺（可見平臺，第1天），并從預設起點（平臺浸入水面下2 cm，第2～6 天）單獨隨機放入面向池壁的水中。起始位置在設備周邊的4 個等距點之間變化。后續試驗中，隨后的起點以順時針方式進行。平臺位置保持不變，允許大鼠游90 s或直到它們找到平臺。在每次試驗中測量到達平臺的時間，并在每個訓練日取平均值。未能在90 s 內找到平臺的大鼠被手動引導到平臺并停留10 s后，放回籠內。每次試驗之間間隔5 min。訓練第7 天，測量撤除平臺后大鼠空間記憶保留情況。將大鼠放入水里并允許在與目標象限相對的象限中單獨游泳90 s。測量大鼠游過平臺所在位置的頻率。

1.7 NeuN免疫組化分析

將脫蠟和重新水化的切片在高溫高壓下（10 min，0.1 M檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0）進行抗原修復，并用3%H2O2孵育以阻斷內源性過氧化酶。dH2O和PBS洗滌后，4°C 抗NeuN（1∶1 000）一抗免疫標記過夜。PBS 清洗后，室溫下將切片與二抗混勻（10 min），PBS 沖洗。用3，3’-二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）對切片進行可視化，并用蘇木精進行反染色，在熒光顯微鏡上成像。DAB陽性細胞的整體光密度（integrated optical density，IOD）通過Image-Pro Plus 6.0分析。

1.8 透射電鏡觀察海馬神經元和突觸的超微結構

MWM測試后，成年大鼠（n=3）用10%水合氯醛深度麻醉，取出海馬組織，2.5%甲醛（4°C）固定2 h，冰PBS 清洗3 次，每次15 min，轉移到2%OsO4PBS溶液中，避光固定2 h。PBS清洗后，室溫下脫水，用50/50 Araldite-Epon（Embed-812）/環氧丙烷混合物浸漬過夜，再用新鮮的Araldite-Epon 混合物浸漬6 h，轉移到充滿Araldite-Epon 混合物的盒中，60 ℃下保持48 h（2.66～3.33 kPa）。在Ultracut E 超微切片機上使用cryotrim 45金剛石刀將組織塊修剪成包含CA1明膠層的梯形。用鉆石刀切成超薄切片（厚度≈50 nm），安裝在Formvar涂層槽柵上，用1%乙酸鈾酯染色45 min，Reynolds檸檬酸鉛染色3 min。在透射電子顯微鏡下拍照記錄。

1.9 Western blotting 檢測PKA-pCREB-BDNF 相關蛋白表達

處死實驗大鼠后，采集海馬區標本并立即置于冰PBS 中。4 ℃條件下，加入蛋白裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，用勻漿器研磨海馬組織。裂解1 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。BCA法檢測樣本蛋白含量，煮沸變性。應用SDS-PAGE 凝膠對40 μg總蛋白進行電泳。濕轉將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白2 h，置于稀釋的抗PKA 抗體（1∶1 000）、抗pCREB 抗體（1∶500）或抗BDNF 抗體（1∶1 000）中4 ℃過夜，TBST 洗3 次后，與辣根過氧化物酶二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。采用ECL 化學發光法顯示蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

1.10 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示。動脈血氣、FJB染色、Western blotting 和免疫組化檢測組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），后進行Dunnet's post hoc 檢驗。MWM 試驗數據用重復測量雙因素方差分析，然后用Bonferroni 多重比較檢驗進行對比。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 5組動脈血氣分析比較

5 組間pH 值、PaCO2、PaO2和SaO2比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明各組大鼠均無代謝或呼吸窘迫異常。

表1 5組動脈血氣分析比較n=5，

表1 5組動脈血氣分析比較n=5，

2.2 異丙酚誘導新生大鼠海馬的神經元細胞凋亡

如圖1A 所示，與對照組相比，異丙酚誘導新生大鼠海馬的FJB陽性細胞增加；與低劑量組相比，接受中和高劑量異丙酚注射的大鼠顯示出更多的FJB陽性細胞（P＜0.05）。對FJB 陽性細胞的定量分析表明，異丙酚（50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg）可引起劑量依賴性的神經凋亡（圖1B），而對照組和脂肪乳劑組的FJB 陽性細胞數量較少，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 異丙酚暴露后新生大鼠（7日齡）海馬FJB染色（n=5）

2.3 異丙酚可誘導大鼠成年后空間學習和記憶障礙

MWM試驗第1天所有大鼠均在邊緣游動以尋找逃生機會，大多數大鼠找不到平臺，且5組大鼠的平均逃逸潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。從第2～6天，異丙酚組大鼠的逃逸潛伏期長于對照組（P＜0.05），見圖2A；跨越原平臺位置的次數減少（P＜0.05），見圖2B。尤其是異丙酚中濃度組比其他兩個劑量的影響更嚴重，平臺跨越次數減少更明顯（P＜0.05）。脂肪乳劑組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 新生大鼠暴露于異丙酚誘發成年后的空間學習和記憶障礙（n=13）

2.4 異丙酚誘發成年大鼠海馬區神經元的損失

MWM 試驗結束后，在海馬CA1 區檢測NeuN陽性細胞的數量（圖3A），通過測量IOD對NeuN陽性細胞進行定量分析（圖3B）。結果發現，對照組和脂肪乳劑組之間NeuN陽性細胞數量比較無顯著差異（P＞0.05）。然而，與對照組相比，新生大鼠異丙酚處理（50 mg/kg、100 mg/kg 和200 mg/kg）可引起成年后海馬區成熟神經元減少（P＜0.05）。

圖3 新生大鼠暴露于異丙酚誘發成年期海馬的神經元損傷（n=5）

2.5 異丙酚損害了海馬CA1 區神經元和突觸的超微結構

透射電鏡結果顯示，異丙酚組大鼠可觀察到海馬神經元的核膜收縮、核染色質凝縮和邊緣化（P＜0.05），見圖4A 和圖4C。而且，異丙酚處理的大鼠海馬神經元線粒體數量減少，部分線粒體腫脹并有紊亂的嵴膜，見圖4B和圖4D，與對照組和脂肪乳劑組相比，異丙酚處理大鼠的突觸結構發生了改變，部分突觸結構紊亂，一些突觸裂隙變得更寬，突觸囊泡減少，以及突觸前膜和突觸后膜的部分融合（P＜0.05）。上述病理變化在對照組和脂肪乳劑組中并不明顯（P＞0.05）。

圖4 新生大鼠暴露于異丙酚會損害海馬CA1區神經元和突觸超微結構

2.6 異丙酚對新生大鼠和成年大鼠海馬區PKACREB-BDNF信號通路均有抑制作用

麻醉后2 h以及MWM試驗結束后，對5組大鼠的海馬PKA、pCREB 和BDNF 蛋白表達進行Western blotting分析。麻醉2 h后，異丙酚組7日齡和成年大鼠海馬區的PKA、pCREB和BDNF蛋白表達水平均低于對照組（均P＜0.05），但無劑量依賴性；對照組和脂肪乳劑組之間無統計學差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 異丙酚誘導7日齡和成年大鼠海馬PKA、pCREB和BDNF蛋白水平下調（n=5）

3 討論

既往研究表明，新生兒異丙酚全身麻醉是日后神經行為異常的重要危險因素[2-3]。雖然大量研究表明新生兒麻醉導致成年期認知功能障礙的原因之一可能是神經元凋亡[1]，但新生兒麻醉導致認知功能障礙的確切機制尚未完全闡明。海馬CA1 區神經元突觸可塑性的改變在認知障礙的發展中發揮著重要作用。因此，本文探究了新生大鼠暴露于異丙酚對海馬CA1 區神經元凋亡以及成年后學習和記憶能力的影響。

眾所周知，麻醉期間的低體溫、低氧、高碳酸或乳酸中毒可能與麻醉誘導的神經毒性有關[12]。在本研究中，大鼠幼崽被安置在一個溫控的孵化器中，在麻醉過程中監測脈搏血氧飽和度，并在異丙酚注射結束后進行血氣分析，所有的生理參數均保持在正常范圍內。結果表明，成年大鼠的學習和記憶障礙不是由系統平衡的非生理性改變引起的，而可能是由新生大鼠接觸異丙酚引起的。近年來，嬰幼兒和新生兒使用麻醉劑的安全性是一個重要問題[13-14]。大腦的某個發育期容易受到全身麻醉劑的影響，這個時期被定義為大腦的快速生長期[15]。人類大腦快速生長期從懷孕中期到出生后2 年，而在嚙齒動物中，發生在出生后的頭14 d[16]。大鼠大腦發育高峰發生在出生后的第7 天，因此使用7 日齡新生大鼠更適合建立麻醉劑后的大腦發育和學習及記憶障礙。

海馬區在學習和記憶過程中起著關鍵作用，特別是在海馬CA1 區[11]。我們的研究發現，異丙酚誘導的海馬CA1區FJB凋亡神經元數量顯著增加，這意味著CA1 區可能容易受到丙泊酚暴露的影響。NeuN是一種中樞和外周神經系統中神經元特異性標志蛋白，位于有絲分裂后的神經細胞核及其周圍，與神經發生密切相關[17]。本文結果顯示，新生大鼠暴露于異丙酚后，成年后海馬神經元明顯減少。除了神經元損失，異丙酚處理明顯引起了神經元形態的長期改變，以及突觸超微結構的顯著紊亂，這種情況在麻醉后至少持續9周。MWM試驗是評估神經行為的標準方法，本研究結果發現，與對照組相比，大鼠尋找平臺的潛伏期增加，穿越平臺的次數減少，這表明異丙酚麻醉可降低成年大鼠的空間學習和記憶能力。

越來越多的研究表明，異丙酚可以通過改變發育中大腦多個基因和蛋白質的相互作用而損害學習和記憶[18]，但精確機制仍不明確。學習和記憶是由神經元可塑性介導的，其中包括現有突觸的持久強化、突觸生成、內在興奮性的調控和成年神經生成[19]。最近研究表明，PKA-CREB-BDNF 信號通路與長期學習和記憶有關[20]。PKA 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在中樞神經系統中廣泛表達并介導細胞內信號轉導，在神經發生、突觸可塑性和記憶形成中發揮重要作用[21]，通過催化各種底物蛋白的磷酸化來調節細胞功能。CREB是一種位于胞核的轉錄調節因子，是多種蛋白激酶的磷酸化底物，如PKA、絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C和鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶[22-23]，CREB介導的基因轉錄和蛋白質合成在長期海馬突觸可塑性和記憶形成中至關重要[24]。pCREB蛋白主要分布在大鼠海馬組織中，招募參與神經發育和神經元形成的CREB轉錄激活結合蛋白，發揮學習和記憶調控功能。BDNF 是CREB 的下游靶基因之一，CREB 磷酸化可促進BDNF 的表達，調控神經元生存、生長、突觸可塑性以及長期學習和記憶[25]。此外，抑制BDNF 信號傳導可在海馬誘發電位長時程增強，這被認為是學習和記憶的神經生理學基礎[26]。本研究中，筆者觀察到異丙酚降低了PKA、pCREB 和BDNF 的表達，海馬依賴性的空間學習記憶能力受損。這些發現與FJB 染色和神經元核抗原免疫組化分析結果一致，對于理解異丙酚對長期學習和記憶的損害的影響非常重要。

綜上所述，新生大鼠暴露于異丙酚會誘發大鼠成年后海馬區FJB 陽性細胞的顯著增加、空間學習和記憶障礙、認知障礙和持久的超微結構異常。此外，在新生大鼠和成年大鼠中均表現出PKA、pCREB和BDNF蛋白表達水平下調。因此，新生大鼠暴露于異丙酚會誘發神經凋亡，并通過失活大鼠海馬的PKA-CREB-BDNF 信號通路損害學習和記憶能力。