宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生風險預(yù)測模型的建立與評價*

梁 漫，龐博華，陽長永，王 鶴

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科二區(qū)，南寧 530021）

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，目前其發(fā)病率排在女性惡性腫瘤第4位[1]，并呈現(xiàn)出上升和年輕化趨勢，嚴重影響女性的生理及心理健康。宮頸癌病因研究一直是國內(nèi)外研究的熱點。目前較為明確的是持續(xù)性的人類乳頭瘤病毒（HPV）感染是造成宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及宮頸癌的關(guān)鍵病因[2]。目前研究中，我國在不同地區(qū)和不同人群中的HPV16感染率基本上都是最高的。在中國大陸目前感染率排在前5 位HPV 亞型分別是HPV16、HPV52、HPV58、HPV53、HPV18[3]。女性陰道微生態(tài)由陰道的解剖結(jié)構(gòu)、微生態(tài)菌群、局部免疫系統(tǒng)及機體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能共同組成，是動態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)[4]。陰道局部能夠通過增強局部自身的抗腫瘤免疫功能，來延緩或者阻止腫瘤的發(fā)生，其不僅受到陰道微生態(tài)平衡的影響，也受其黏膜免疫防御系統(tǒng)、局部免疫細胞以及其分泌的細胞因子的調(diào)節(jié)。本研究對單純HPV16、HPV18、HPV52、HPV58陽性患者其陰道微生態(tài)、陰道灌洗白細胞介素（IL）-2、IL-10免疫因子及CD4+或CD8+T 細胞水平進行檢測，對比分析HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染相關(guān)的宮頸病變對對陰道微生態(tài)及局部免疫狀態(tài)的影響及分析相關(guān)的危險因素，最終建立相關(guān)的CIN發(fā)生風險預(yù)測模型并進行驗證，為臨床改變陰道微環(huán)境及局部免疫狀態(tài)、降低CIN 發(fā)生風險及CIN 的早診早治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018 年6 月至2020 年6 月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科行宮頸癌篩查或因?qū)m頸病變就診的患者行HPV 檢測，最終選取單純HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 陽性的患者共155 例，其中HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 陽性患者分別為88 例、14 例、33 例和20 例，同期選取HPV 陰性患者71 例為陰性對照。以上患者均在初診時常規(guī)進行陰道微生物檢測及陰道灌洗。病例納入標準：（1）經(jīng)高危型人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）檢測結(jié)果為單純HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 陽性或HPV 陰性；（2）年齡18～72 歲；（3）既往有性生活史，非月經(jīng)期、非妊娠期及非哺乳期婦女；（4）月經(jīng)干凈超過3 d；（5）取材前3 d內(nèi)無性生活、無婦科檢査、無陰道沖洗及陰道內(nèi)用藥；（6）近1 個月無抗生素服用史；（7）未用免疫抑制劑或激活劑。排除標準：（1）年齡小于18歲或大于72歲；（2）無性生活史；（3）處于月經(jīng)期、妊娠期、哺乳期；（4）取材前3 d 內(nèi)有性生活、婦科檢査、陰道沖洗及陰道內(nèi)用藥；（5）近1 個月有抗生素服用史；（6）使用免疫抑制劑或激活劑；（7）高血壓、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤等病史者；（8）曾接受如淋巴結(jié)切除術(shù)、脾切除術(shù)等損害機體免疫功能的手術(shù)治療者；（9）曾接受化療、放療及免疫系統(tǒng)治療者。本研究已取得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本采集

1.2.1 陰道微生態(tài)檢測 患者取膀胱截石位，利用不涂潤滑劑的陰窺器暴露陰道，先用精密pH 試紙接觸陰道壁，30 s 后取出，與標準色板比較讀取pH值。檢測出陰道pH值；常規(guī)于陰道側(cè)壁中上1/3處取分泌物涂片，用于檢查霉菌、線索細胞、乳酸桿菌、滴蟲等微生物。

1.2.2 陰道局部免疫因子及T細胞亞群的檢測

用一次性10 mL無菌注射器取5 mL生理鹽水，沖洗陰道后穹窿及宮頸部，回吸收集陰道灌洗液大約5 mL，存放于無菌離心管內(nèi)，離心10 min（2 000 bpm），收集上清液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測IL-2、IL-10、CD4+及CD8+的檢測，并在-20°C冰箱保存，避免反復(fù)凍融，并計算CD4+/CD8+比值。

1.2.3 HPV 檢測 采用HPV 檢測專用取樣工具在宮頸口處取樣并保存于樣品管內(nèi)，送往檢驗中心檢驗。

1.2.4 宮頸病變檢查 對以上患者選取經(jīng)病理學(xué)檢查或?qū)m頸液基脫落細胞學(xué)檢査確定宮頸病變程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件及R3.6.2 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。CIN 危險因素應(yīng)用單因素及多因素向前逐步Logistic 回歸，應(yīng)用R3.6.2軟件中的rms建立預(yù)測模型并制作列線圖（nomogram）。通過受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評估預(yù)測模型的區(qū)分度；運用校準曲線實現(xiàn)（bootstrap 1 000 次抽樣）評估預(yù)測模型預(yù)測概率與實際概率的一致性；臨床決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評估預(yù)測模型的臨床適用性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 感染情況進行分組的陰道微生態(tài)檢測結(jié)果

各組間陰道中pH≤4.5、乳酸桿菌、滴蟲、霉菌、線索細胞比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染的陰道微生物狀態(tài)檢測結(jié)果分析

2.2 根據(jù)HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 感染情況進行分組的的陰道局部免疫因子及T細胞亞群分析

HPV16（+）組、HPV52（+）組中IL-2 水平低于HPV（-）組（P＜0.05）；HPV16（+）組中IL-10 水平高于HPV（-）組（P＜0.05）；HPV16（+）組IL-10 水平高于HPV58（+）組（P＜0.05）；HPV16（+）組、HPV58（+）組中CD4+低于HPV（-）組（P＜0.05），見表2。

表2 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染的陰道局部免疫狀態(tài)檢測結(jié)果

表2 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染的陰道局部免疫狀態(tài)檢測結(jié)果

與HPV（-）組比較，aP＜0.05；與HPV16（+）組比較，bP＜0.05。

2.3 根據(jù)宮頸病變情況分組的陰道微生物狀態(tài)及HPV檢測結(jié)果

CIN 組HPV（+）檢出率高于慢性炎癥組（P＜0.05）。CIN組陰道pH（≤4.5）陽性檢出率低于慢性炎癥組（P＜0.05）；CIN組乳酸桿菌、滴蟲、線索細胞與慢性炎癥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 宮頸病變的陰道微生物狀態(tài)及HPV檢測結(jié)果

2.4 根據(jù)宮頸病變情況分組的陰道局部免疫檢測結(jié)果

CIN 組陰道局部免疫因子IL-2、CD4+、CD4+/CD8+比值低于慢性炎癥組，IL-10 高于慢性炎癥組（P＜0.05）；CIN 組CD8+與慢性炎癥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 宮頸病變的陰道局部免疫狀態(tài)檢測結(jié)果

表4 宮頸病變的陰道局部免疫狀態(tài)檢測結(jié)果

2.5 陰道微環(huán)境及陰道局部免疫狀態(tài)中導(dǎo)致CIN的危險因素分析結(jié)果

納入HPV、IL-2、IL-10、CD4+、CD4+/CD8+比值等構(gòu)建多因素Logistic回歸方程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV感染（P=0.000）、IL-2 降低（P=0.000）、IL-10 升高（P=0.001）、CD4+低表達（P=0.029）是CIN發(fā)生的危險因素；而CD4+/CD8+比值對CIN 發(fā)生無明顯影響（P=0.881），見表5。

表5 CIN的多因素Logistic危險因素分析結(jié)果

2.6 基于陰道微生態(tài)及局部免疫相關(guān)的CIN 發(fā)生風險預(yù)測模型的建立

通過多因素采用向前逐步Logistic 回歸，得出的具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義的4 個預(yù)測因素HPV（+）、IL-2、IL-10、CD4+納入、建立并繪制CIN發(fā)生風險預(yù)測模型，以列線圖模型呈現(xiàn)，見圖1。

圖1 CIN發(fā)生風險列線圖模型

2.7 模型的預(yù)測性能評估

繪制ROC 曲線，結(jié)果見圖2，ROC 曲線下面積（AUC）為0.920，95%CI（0.882～0.958）超過0.9，表明該模型對于CIN 發(fā)生風險的預(yù)測能力有較高準確性。校準曲線為斜率接近于1 的直線，表明CIN的實際發(fā)生風險和預(yù)測的可能性之間有很好的相關(guān)性（圖3）。此外，霍斯莫—萊梅肖檢驗擬合度（hosmer and lemeshow test）方法來檢驗?zāi)Ｐ偷臄M合優(yōu)度，當P＞0.05，認為當前數(shù)據(jù)中的信息已經(jīng)被充分提取，模型擬合優(yōu)度較高，當P＜0.05，則模型校準度差，表明實際觀測值與模型預(yù)測值之間存在一定差異。本模型Hosmer-Lemeshow 的檢驗水準P=0.4831 也表明此次預(yù)測模型的擬合優(yōu)度較高，與理想模型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 列線圖模型的ROC曲線及AUC

圖3 列線圖模型的校準曲線

2.8 模型的決策曲線分析

通過計算模型的凈效益，應(yīng)用決策曲線分析評估預(yù)測模型的臨床價值及臨床適用性（圖4）。從圖4 中可知，在閾值范圍內(nèi)（橫坐標）該預(yù)測模型的凈獲益率曲線（紅線）均在兩條極端線（黑線和灰線）的上方，即表明該預(yù)測有較大的閾值以及較好的臨床適用性。因此，本決策曲線分析顯示：在相同閾概率（橫坐標）下，使用當前研究中的列線圖（紅線）來預(yù)測CIN 發(fā)生風險要比極端曲線（黑線和灰線）策略更獲益。

圖4 列線圖預(yù)測CIN的臨床決策曲線

3 討論

本文通過研究目前感染率較高的HPV 亞型HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 對局部陰道微生態(tài)及局部陰道免疫狀態(tài)的相關(guān)性，建立CIN風險預(yù)測模型并進行評價。本研究結(jié)果顯示CIN組HPV（+）檢出率較慢性炎癥組高，多因素分析也證實HPV感染是CIN發(fā)生的危險因素，目前認為持續(xù)HPV感染是導(dǎo)致CIN及宮頸癌的關(guān)鍵病因。HPV通過感染、整合、癌變參與宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展[4]。與既往研究中認為持續(xù)性HPV 感染是CIN 主要病因相一致[2]。

本研究中CIN 組陰道pH（≤4.5）陽性檢出率低于與慢性炎癥組，說明陰道pH 值的升高可能導(dǎo)致正常宮頸向CIN 轉(zhuǎn)變。Curty 等[6]研究表明，女性陰道中以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌種能夠促進HPV 的清除及減少宮頸病變的發(fā)生。另外，也有研究表明陰道，pH 值的升高是CIN 發(fā)生的危險因素[7]。Norenhag等[8]的系統(tǒng)回顧和薈萃分析提示，陰道中的乳酸桿菌與HPV感染顯著相關(guān)。

本研究中結(jié)果顯示，HPV16（+）組、HPV52（+）組IL-2 水平低于HPV（-）組，HPV16（+）組、HPV58（+）組IL-10 水平高于HPV（-）組，HPV16（+）組IL-10 水平高于HPV58（+）組。Th2 細胞型因子如IL-4、IL-10 在腫瘤患者體內(nèi)處于優(yōu)勢地位，HPV 感染后導(dǎo)致宮頸組織向Th2細胞偏移發(fā)生偏移導(dǎo)致Th1/Th2失衡，使IL-2等Th1細胞型因子等合成減少，IL-4、IL-10 等Th2 細胞型因子合成增加［9］。本研究結(jié)果顯示，在HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 這4 個亞型感染導(dǎo)致陰道局部Th1/Th2 免疫平衡也向Th2細胞偏移明顯。另外，本研究結(jié)果也表明，IL-2、IL-10是誘導(dǎo)宮頸病變的重要因子，在感染HPV 后，會出現(xiàn)免疫抑制的情況，表現(xiàn)為IL-2 水平降低，IL-10水平升高[10]，這與Westrich 等[11]研究相一致。本研究證實IL-2 降低、IL-10 升高是CIN 發(fā)生的危險因素。

本研究結(jié)果顯示，HPV16（+）組、HPV58（+）組中CD4+水平低于HPV（-）組；CIN 組陰道局部CD4+、CD4+/CD8+水平低于慢性炎癥組。這與唐清華等[12]報道的結(jié)果相一致。CD4+/CD8+作為T 細胞亞群，在調(diào)節(jié)細胞免疫反應(yīng)以及維持機體免疫平衡方面具有重要作用。本研究中，HPV16、HPV58 感染主要表現(xiàn)為CD4+細胞的缺陷；而CIN組陰道局部CD4+、CD4+/CD8+水平低于慢性炎癥組，說明CD4+的低表達及CD4+/CD8+的比例失衡，可導(dǎo)致宮頸免疫應(yīng)答的減弱，從而導(dǎo)致宮頸向CIN的轉(zhuǎn)化。同時本研究結(jié)果表明CD4+低表達是CIN 發(fā)生的獨立危險因素。

在臨床研究中，臨床預(yù)測模型是精準醫(yī)學(xué)研究的重要工具[13]。本研究建立了基于4 個預(yù)測因素HPV（+）、IL-2、IL-10、CD4+的CIN發(fā)生風險預(yù)測列線圖模型。對該模型的預(yù)測效能驗證表明：列線圖的AUC=0.920，超過0.9，表明該模型對于CIN 發(fā)生風險的預(yù)測能力有較高準確性；校準曲線為斜率接近于1 的直線，表明實際CIN 發(fā)病率和預(yù)測的可能性之間有很好的相關(guān)性。本模型Hosmer-Lemeshow 的檢驗水準P=0.4831 也表明此次預(yù)測模型的擬合優(yōu)度較高，和理想模型沒有統(tǒng)計學(xué)差異。并且臨床決策曲線結(jié)果顯示，在相同閾概率下，使用當前研究中的列線圖來預(yù)測CIN 發(fā)生風險要比極端曲線策略更獲益說明該預(yù)測模型具有臨床適用性。以上驗證表明，本文建立了一個預(yù)測效能良好的CIN發(fā)生風險預(yù)測模型。陳嫻等[14]研究中確定吸煙史、TCT、HPV、陰道鏡影像診斷、病變面積/宮頸面積預(yù)測因子建立CIN2+的列線圖預(yù)測模型具有良好的區(qū)分度與精確度。

綜上所述，本研究建立的CIN 預(yù)測模型具有良好的預(yù)測效能。但由于該模型是基于單中心、回顧性數(shù)據(jù)，并且僅做了內(nèi)部驗證，缺乏外部的驗證集及前瞻性數(shù)據(jù)的驗證，因此，本預(yù)測模型仍存在一定的局限性，未來應(yīng)開展聯(lián)合多中心的前瞻性研究對該模型進行驗證，進一步評估其穩(wěn)定性并投入到臨床的工作中。