血清外泌體miR-22-3p與類風濕性關節炎病情嚴重程度的關系研究*

龐琳烜，楊西超，李治琴，杜望磊

（空軍軍醫大學第一附屬醫院臨床免疫科，西安 710032）

類風濕性關節炎是一種常見病，致殘率較高[1]，其早期診斷主要依靠臨床表現、影像學檢查及實驗室檢查。該病臨床表現多樣，檢查指標的靈敏度較低，限制了對該病的早期診斷，延誤了最佳治療時間，不利于患者預后[1]。外泌體是直徑為40～100 nm的盤狀囊泡，來源于細胞溶酶體微粒內陷形成的囊泡，被釋放到細胞外基質中，內含蛋白質、脂質、微小RNA（microRNA，miRNA）、環狀RNA等，可參與多種生物學過程[2]。其中miRNA 是一類長度為20～24 個核苷酸的小RNA，在外泌體中穩定存在，可隨著外泌體循環被遠處或鄰近細胞所攝取，參與多種病理生理過程[3]。研究發現，在類風濕性關節炎患者的外周血中有多種miRNA 呈異常表達，miRNA 對心血管疾病、腎臟疾病、腫瘤等有一定的臨床診斷價值[4-5]。miR-22-3p是近年來新發現的一種miRNA，在類風濕性關節炎中的表達及意義鮮少報道。有研究發現，類風濕性關節炎患者血漿及外周血單個核細胞中miR-22-3p表達水平升高[6-7]。本研究從類風濕性關節炎患者外周血中提取外泌體，探討血清外泌體miR-22-3p與類風濕性關節炎病情嚴重程度的關系及其早期診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年12 月至2021 年12 月空軍軍醫大學第一附屬醫院收治的類風濕性關節炎患者100例（類風濕性關節炎組），其中處于活動期64 例，緩解期36 例；男39 例，女61 例；年齡38～71 歲，平均（53.19±3.08）歲；體重指數（21.12±2.01）kg/m2。病例納入標準：（1）符合類風濕性關節炎的診斷標準[8]；（2）年齡≥18 歲；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）急慢性感染性疾病；（2）腫瘤；（3）免疫缺陷；（4）代謝性疾病。另選取同期在本院行體格檢查的健康志愿者100例為對照組，其中男42例，女58例；年齡35～68 歲，平均（52.09±4.11）歲；體重指數（21.56±2.33）kg/m2。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌體的分離和鑒定 采集患者晨起空腹肘靜脈血1 mL，2 000 r/min 離心15 min，留取血清，于-80 ℃冰箱保存備用。用外泌體提取試劑盒（西安齊岳生物科技有限公司）提取血清外泌體。取10 μL外泌體加于銅網上，沉淀1 min。加入10 μL 2%醋酸雙氧鈾于銅網上沉淀1 min。常溫下干燥15 min，隨后用JEM-2100F 透射電子顯微鏡（上海研酷檢測中心）觀察。

用Western blotting 法檢測外泌體標志物TSG101 和CD63 的蛋白表達[9]。用RAPI裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度；10% SDSPAGE 電泳分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗TSG101（1∶10 000，美國Sigma 公司）、CD63（1∶200，美國Sigma 公司）4 ℃冰箱孵育過夜，用TBST 緩沖液洗膜3 次后加入二抗，室溫下孵育2 h，ECL 發光儀進行蛋白成像。

1.2.2 紅細胞沉降率（ESR）和C反應蛋白（CRP）檢測 用免疫酶化學發光儀（法國梅里埃公司）檢測ESR 和CRP，ESR 的檢測用魏氏法，CRP 的檢測用免疫比濁法。

1.2.3 實時熒光定量PCR 法檢測外泌體miR-22-3p表達水平 用Trizol 法提取總RNA，反轉錄為cDNA，用熒光定量試劑盒（西安齊岳生物科技有限公司）進行PCR 擴增，用2-△△CT法計算miR-22-3p相對表達量。引物序列：miR-22-3p上游5’-GGCGATCATACTGGGAGATG-3’，下游5’-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3’；內參U6上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.2.4 類風濕性關節炎Steinbrocker 影像學分級及病情活動度評分 根據手與腕部X 線檢查，進行Steinbrocker分級[10]：（1）I級：正常或者可能存在骨質疏松；（2）Ⅱ級：骨質疏松伴有軟骨下骨質破壞，輕度關節間隙狹窄；（3）Ⅲ級：明顯關節面下骨質破壞、關節變形、關節間隙狹窄，但無纖維性或者骨性強直；（4）Ⅳ級：除Ⅱ級、Ⅲ級表現外，伴有纖維性或者骨性強直。類風濕性關節炎活動度評價表（DAS28）[11]：疾病緩解為＜2.6 分；低活動度為2.6～3.2分；中度活動度為＞3.2分且≤5.1分；高活動度為＞5.1分。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；兩組獨立樣本間比較用獨立樣本t檢驗。相關性分析用Pearson檢驗。用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清外泌體miR-22-3p 診斷類風濕性關節炎的價值，計算曲線下面積（AUC）、靈敏度和特異度。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清外泌體的鑒定

顯微鏡下可觀察到外泌體呈囊泡狀，直徑約為40～100 nm（圖1 白色箭頭所示）。Western blotting實驗可檢測到外泌體標志物TSG101及CD63（圖2）。

圖1 透射電子顯微鏡觀察外泌體（×50 000）

圖2 Western blotting法檢測外泌體標志物TSG101及CD63

2.2 兩組血清外泌體miR-22-3p表達水平比較

類風濕性關節炎組血清外泌體miR-22-3p相對表達量為（1.78±0.34），高于對照組的（0.72±0.21）（P＜0.05）。ROC 曲線顯示：血清外泌體miR-22-3p診斷類風濕性關節炎的AUC為0.82，診斷最佳臨界值為1.54，靈敏度和特異度分別為82.39%和74.15%，見圖3。

圖3 血清外泌體miR-22-3p診斷類風濕性關節炎的ROC曲線

2.3 類風濕性關節炎患者血清外泌體miR-22-3p表達水平與Steinbrocker分級、病情活動度的關系

Steinbrocker Ⅳ級患者血清外泌體miR-22-3p表達量為（2.03±0.71，n=32）、Ⅲ級為（1.79±0.45，n=40）、Ⅱ級為（1.53±0.23，n=28），分級越高，表達水平越高（F=19.347，P＜0.001）。活動期患者血清外泌體miR-22-3p表達量為（2.10±0.45，n=64），高于緩解期患者的（1.45±0.30，n=39）（P＜0.05）。重度活動度患者血清外泌體miR-22-3p表達量為（2.40±0.76，n=26），中度活動度為（2.00±0.38，n=20），輕度活動度為（1.89±0.21，n=18），活動度越高，表達水平越高（F=8.564，P=0.002）。

2.4 類風濕性關節炎患者血清外泌體miR-22-3p表達水平與ESR、CRP的關系

血清外泌體miR-22-3p 分別與ESR、CRP 呈正相關關系（r=0.307，r=0.370，P＜0.05），見圖4。

圖4 類風濕性關節炎患者血清外泌體miR-22-3p表達水平與ESR、CRP的相關性分析

3 討論

miR-22-3p在腎臟損傷[12]、高血壓[13]、心肌梗死[14]和癌癥[15]等多種疾病中有異常表達。本研究發現，類風濕性關節炎組血清外泌體中miR-22-3p 表達水平明顯高于對照組，與既往研究結果相一致[7]；ROC 曲線分析顯示，血清外泌體miR-22-3p 對類風濕性關節炎有一定的診斷價值。本研究結果提示miR-22-3p表達上調可能促進類風濕性關節炎的發生和發展，可能與miR-22-3p 介導免疫炎癥損傷有關[16]。

ESR、CRP 與類風濕性關節炎病情活動度有關[17]。本研究中，活動期患者血清外泌體miR-22-3p表達量高于緩解期患者。患者活動度越高，血清外泌體miR-22-3p 表達水平越高。另外，血清外泌體中miR-22-3p表達水平與ESR、CRP表達水平有關，表明外泌體中miR-22-3p可以作為評估類風濕性關節炎病情活動性的參考指標。本研究采用Steinbrocker 影像學分級對類風濕性關節炎病情進行評價，結果顯示，Steinbrocker分級越高，患者血清外泌體miR-22-3p表達水平越高。說明血清外泌體miR-22-3p可評估關節破壞的進展。以上結果說明血清外泌體miR-22-3p可能作為監測類風濕性關節炎活動性、判斷影像學進展的指標。

本研究也存在一些局限性：（1）本研究檢測了類風濕性關節炎患者血清外泌體miR-22-3p表達水平及臨床意義，但是未分析其作用機制，未來需要開展細胞及動物研究進行探討；（2）未對患者進行隨訪，外泌體miR-22-3p 與類風濕性關節炎病情動態變化的關系需要未來進行研究；（3）本研究顯示外泌體miR-22-3p對類風濕性關節炎有一定診斷價值，但是如何進一步提高靈敏度和特異度仍需研究。

綜上所述，本研究發現類風濕性關節炎患者血清外泌體miR-22-3p 表達水平升高，對疾病早期診斷有一定價值。血清外泌體miR-22-3p與疾病活動性和影像學進展相關，可能成為類風濕性關節炎的生物學指標。未來需要深入探討miR-22-3p在類風濕性關節炎發生及發展中的機制。