長鏈非編碼RNA SRGAP3-AS2異常表達通過Janus激酶信號調節非小細胞肺癌侵襲和遷移

李新 蓋慧榮 宋蕾 張忠法

長鏈非編RNA(long noncoding RNA,LncRNA)與包括肺癌的多種腫瘤發生發展，侵襲轉移有關，發揮重要致癌或抑癌作用[1-2]。SRGAP3反義RNA 2(SRGAP3 antisense RNA 2,SRGAP3-AS2)是一種新發現的LncRNA分子，Yang等[3]通過芯片分析發現,肺腺癌組織中SRGAP3-AS2表達缺失，提示其在肺癌進展中可能發揮積極作用，但SRGAP3-AS2在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的功能未知。Janus激酶/轉錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路持續激活可促進腫瘤惡性轉化[4]。調控JAK/STAT軸可調控NSCLC腫瘤活性[5-7]。但SRGAP3-AS2是否通過JAK/STAT信號通路影響NSCLC進程尚未知。本研究擬分析過表達SRGAP3-AS2介導JAK/STAT信號對NSCLC增殖、遷移和侵襲的影響。

對象與方法

一、對象

取2019年1月～2021年12月在我院經外科手術治療的63例NSCLC病人的腫瘤組織及癌旁組織。人正常肺上皮細胞株BEAS-2B和人NSCLC細胞株(H1650、H1975、H1299、A549和H23)均購自中國科學院細胞庫。試劑：LipofectamineTM 3000轉染試劑(美國賽默飛公司)；qRT-PCR熒光定量試劑盒和反轉錄試劑盒均購自大連寶生物有限公司；MTT試劑盒和蛋白定量試劑盒均購自南京曼夫特生物科技有限公司；兔源一抗GAPDH、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotinase,MMP-2)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Janus激酶2(Janus kinase,JAK2)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)和HRP標記的二抗均購自美國Abcam公司；SRGAP3-AS2過表達載體(通用生物技術有限公司)；JAK2激活劑Coumermycin A1(美國MCE公司)。

二、方法

1.細胞分組：構建SRGAP3-AS2過表達載體pcDNA3.1-SRGAP3-AS2。取H23，將空載、過表達載體轉染到細胞，即對照組、SRGAP3-AS2過表達組和SRGAP3-AS2過表達+JAK2激活劑組。

2.MTT實驗：酶標儀測定細胞轉染0 小時、24 小時、48 小時和72 小時，吸光度值(OD490)。

3.劃痕實驗：記錄各組24 小時細胞劃痕。

4.Transwell小室實驗：記錄各組24 小時的侵襲細胞數。

5.qRT-PCR實驗：以qRT-PCR檢測細胞轉染處理48 小時的JAK通路相關因子RNA。SRGAP3-AS2：上游5'-CGTCATCCACACCACAGATCAG-3'，下游5'-TTGTTGGAGCCATCACAGCAC-3'。MMP-2：上游5'- TCTCCTGACATTGACCTTGGC-3'，下游5'- CAAGGTGCTGGCTGAGTAGATC-3'。Bcl-2：上游5'-TCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'，下游5'-CAGAGTCTTCAGAGACAGCCAGGA 3'。GAPDH：上游5'-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游5'-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3'。

6.Western blot：以Western blot檢測細胞轉染處理48 小時的MMP-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達。

三、統計學分析

結果

1.SRGAP3-AS2表達比較：癌旁組織SRGAP3-AS2表達為1.000±0.087，NSCLC組織為0.531±0.052，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.SRGAP3-AS2表達與NSCLC臨床病理特征關系見表1。以肺癌組織SRGAP3-AS2的中位表達水平為1.401，將病人分為SRGAP3-AS2低表達組和高表達組，結果表明，NSCLC組SRGAP3-AS2表達與淋巴結轉移和TNM分期有關(P<0.05) 。

表1 SRGAP3-AS2表達與NSCLC臨床病理特征關系(例)

3.SRGAP3-AS2在NSCLC細胞表達：SRGAP3-AS2在H1650的表達為0.87±0.03，H1975的表達為0.78±0.04，H1299的表達為0.61±0.03，A549的表達為0.49±0.03，H23的表達為0.41±0.02，與BEAS-2B細胞表達(1.00±0.03)比較，均呈低表達，差異有統計學意義(P<0.05)。選擇H23細胞進行后續實驗。

4.SRGAP3-AS2轉染驗證：對照組SRGAP3-AS2為1.028±0.063，過表達組為52.417±0.503，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

5.SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制NSCLC細胞增殖：與對照組比較，SRGAP3-AS2過表達組細胞活力減弱(48 h和72 h，P<0.05)；與SRGAP3-AS2過表達比，SRGAP3-AS2過表達+JAK2激動劑組細胞活力增強(48 小時和72 小時，P<0.05)。見表2。

表2 SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制NSCLC細胞增殖

6.SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制肺癌細胞的遷移：對照組細胞劃痕愈合率為(78.67±3.26)%，SRGAP3-AS2過表達組為(45.20±2.43)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)；SRGAP3-AS2過表達+JAK2激動劑組細胞劃痕愈合率為(81.47±3.81)%，與SRGAP3-AS2過表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制H23細胞的遷移(×100)

7.SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制肺癌細胞的侵襲：對照組細胞侵襲數為285.33±5.36，SRGAP3-AS2過表達組為112.67±6.49，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)；SRGAP3-AS2過表達+JAK2激動劑組為281.33±5.78，與SRGAP3-AS2過表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A.對照組;B.SRGAP3-AS2過表達組;C.SRGAP3-AS2過表達+JAK2激動劑組圖2 SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制H23細胞的侵襲(結晶紫染色×100)

8.SRGAP3-AS2影響JAK通路相關因子表達：與對照組比較，SRGAP3-AS2過表達組MMP-2和Bcl-2的mRNA及蛋白、JAK2和STAT3的蛋白表達減少(P<0.05)；與SRGAP3-AS2過表達比，SRGAP3-AS2過表達+JAK2激動劑組MMP-2和Bcl-2的mRNA及蛋白、JAK2和STAT3的蛋白表達增加，差異有統計學意義(P<0.05) 。見表3。

表3 SRGAP3-AS2影響JAK通路相關因子表達

討論

NSCLC的預后較差，5年總生存率(overall survival,OS)僅為19.8%[8-9]。目前，關于NSCLC進展和轉移的確切分子機制尚不清楚，了解NSCLC潛在分子調控網絡及鑒定潛在治療靶標和預后生物標志物對延長病人生存至關重要[10-11]。LncRNA可作為生物標志物在包括NSCLC在內的各種惡性腫瘤的診治和預后中發揮重要作用。盡管已有LncRNA在NSCLC作用的相關報道，然而NSCLC中LncRNA的功能和表達相對較少。

本研究顯示，NSCLC組織中SRGAP3-AS2呈低表達，與淋巴結轉移和TNM分期有關，同時SRGAP3-AS2在不同的NSCLC細胞株均呈低表達。與文獻報道一致[3]。Jin等[12]通過整合GEO數據庫中兩個數據集(GSE70880和GSE113852)，構建競爭性內源RNA網絡和蛋白質-蛋白質相互作用PPI網絡，識別肺腺癌中潛在診斷和預后生物標志物，發現SRGAP3-AS2處于網絡調控的關鍵中心節點，具有較高的肺腺癌診斷預測價值。本研究顯示過表達SRGAP3-AS2顯著促進了H23細胞增殖、侵襲與遷移，抑制了Bcl-2和MMP-2的mRNA及蛋白表達，同時抑制JAK2和STAT3表達。

報道顯示，22%～65%的 NSCLC病人STAT蛋白受到JAK激活發生磷酸化[13]。JAK/STAT信號通路通過激活關鍵促轉移基因，促進細胞增殖和轉移。在正常細胞中，STAT激活受到限制，但當STAT被激活，可誘發相關調控腫瘤細胞增殖、運動、血管生成和免疫逃逸基因異常表達，影響NSCLC進展，提示增強SRGAP3-AS2表達明顯抑制JAK2/STAT3信號軸活性[14]。進一步，SRGAP3-AS2過表達+JAK2激活劑Coumermycin A1處理H23細胞后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力均強于SRGAP3-AS2過表達處理組，Bcl-2和MMP-2上調，說明JAK2激活劑逆轉了SRGAP3-AS2過表達對H23細胞增殖、遷移和侵襲產生的抑制作用，SRGAP3-AS可介導JAK/STAT抑制NSCLC細胞的增殖和轉移。

綜上，NSCLC組織SRGAP3-AS2呈低表達，與淋巴結轉移和TNM分期有關，過表達SRGAP3-AS2可抑制JAK2/STAT3信號，抑制NSCLC細胞H23增殖、遷移和侵襲。