電針通過抑制瘦素/親肽素軸改善多囊卵巢綜合征模型大鼠排卵功能障礙及性激素水平

郭敏，楊雁鴻，盧宗林，趙嘉梅，溫瑩瑩，張艷艷，劉杰

（1.洛陽市中醫院婦科門診，河南洛陽 471000；2.河南省中醫藥研究院，河南鄭州 450000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是青春期和育齡期女性常見的生殖內分泌代謝紊亂性疾病，臨床以持續無排卵、排卵不足、胰島素抵抗、雄激素分泌過多和卵巢多囊性改變為主要特征，同時還存在著遠期并發癥包括糖代謝異常和代謝綜合征、心腦血管疾病、腫瘤風險及心理問題等的危險[1-2]。目前，PCOS的治療主要以改變生活方式、藥物誘導排卵為主[3]；但研究發現，藥物治療過程可能產生卵巢過度刺激綜合征風險，且停藥后復發率較高[4]。作為傳統的中醫療法，針灸在治療婦科疾病方面有著悠久的歷史。電針作為一種低風險的干預措施，已被證明有明顯糾正PCOS內分泌紊亂、促進排卵的作用[5-7]，但其具體治療機制仍不清楚。促性腺激素釋放激素（GnRH）是生殖軸的主要控制器，調節促性腺激素的合成和分泌，親肽素（kisspeptin，KP）是已知誘導GnRH釋放的最有效因子，而KP神經元則是介導瘦素（leptin，LEP）作用于下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的直接靶點。研究表明，LEP/KP軸在生殖功能尤其是卵巢發育及激素分泌等方面具有重要的調節意義[8-9]。故本研究通過構建PCOS大鼠模型，給予電針治療，并以治療PCOS的標準藥物二甲雙胍[10]作為陽性對照，觀察電針對PCOS大鼠LEP/KP軸的影響，以期闡明電針對PCOS的干預機制及為電針臨床治療PCOS方案提供一定的參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級5周齡雌性Wistar大鼠70只，體質量為（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0013。飼養環境：室溫（22±2）℃，相對濕度50%～70%，12 h/12 h光暗交替，普通飼料喂養。研究過程遵循實驗動物人道主義及3R原則。

1.2 主要藥物、試劑與儀器二甲雙胍（純度≥98%，寶雞市國康生物科技有限公司，批號：657-24-9）。脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA，純度≥98%，美國Med Chem Express公司，批號：HY-14650）；LEP酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）；雌二醇（E2）、睪酮（T）ELISA試劑盒（上海恒遠生化試劑有限公司）；促黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）ELISA試劑盒（上海通蔚生物有限公司）；兔抗瘦素受體（LEPR）多克隆抗體（艾美捷科技有限公司）；兔抗KP、兔抗G蛋白偶聯受體54（GPR54）、兔抗促性腺激素釋放激素（GnRH）等多克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（北京百奧萊博科技有限公司）。低頻脈沖電針治療儀（上海聚慕醫療器械有限公司）；多功能酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；化學發光凝膠成像系統（北京佰樂良成科技有限公司）。

1.3 造模與分組大鼠適應性飼養1周后，稱體質量，隨機選取15只作為正常組，剩余55只用于構建PCOS模型。造模方法[11]：連續21 d于大鼠頸背部皮下注射DHEA，劑量為60 mg/kg，每日1次。正常組僅注射0.2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）。造模期間通過陰道涂片亞甲藍染色觀察大鼠連續10 d的發情周期，陰道壁細胞以有核上皮細胞為主表明處于發情前期，以角化鱗狀上皮細胞為主表明處于發情期，若發情周期紊亂則判斷為PCOS大鼠造模成功[12-13]。結果48只大鼠造模成功。隨機剔除3只，將剩余45只大鼠隨機分為模型組、電針組及西藥組，每組各15只，稱體質量。

1.4 電針刺激及給藥成模24 h后，給予電針及藥物治療。電針組給予電針干預：木板上固定大鼠，剃除穴位處被毛，不銹鋼針（直徑0.30 mm，長13 mm）插入雙側足三里（ST36，脛骨前結節點外側4 mm處）6～7 mm深度，三陰交（SP6，內側踝近端3 mm，位于脛骨后緣）4～5 mm深度，連接脈沖電針儀，頻率設為2 Hz，電流強度為2 mA，持續30 min。正常組、模型組及西藥組大鼠均給予非穴位點（ST36下側5 mm、SP6下側5 mm）電針干預。另西藥組大鼠給予二甲雙胍灌胃，劑量為300 mg/kg[14]，正常組、模型組、電針組大鼠灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續15 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 樣本采集及處理 治療結束后，處于發情期各組大鼠禁食8 h，稱體質量，腹腔內注射70 mg/kg氯胺酮及10 mg/kg甲苯噻嗪麻醉，心臟穿刺采集血液，以3 000 g、4℃離心10 min，收集血清保存于-80℃冷凍備用；采血后，頸椎脫臼處死大鼠，解剖并收集腦組織，分離出下丘腦弓狀核保存于液氮內備用；腹側正中線作切口，取出卵巢并去除多余脂肪組織，稱質量并測量直徑，后將卵巢組織保存于4%多聚甲醛固定液中過夜備用。

1.5.2 HE染色法觀察大鼠卵巢組織病理形態 卵巢組織于體積分數4%多聚甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋并制備為5μm厚度切片。二甲苯脫蠟至水，滴加適量蘇木素染核5 min，1%鹽酸酒精分化10 s，0.6%氨水返藍，流水沖洗后滴加適量伊紅染液染色30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。于400倍顯微鏡鏡下觀察卵巢組織病理形態，并測量囊性卵泡（CF）、發育中卵泡（DF）及黃體（CL）數量。

1.5.3 ELISA法檢測大鼠血清內相關激素水平 設置標準品孔和樣本孔，根據說明書加入標準品和樣品（樣品5倍稀釋）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體37℃溫育1 h。甩干液體，洗板機洗板4～5次，加底物A、B各50μL，37℃避光孵育15 min，終止液終止反應。應用酶標儀于450 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各組大鼠血清中LEP、E2、T、LH及FSH水平。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠下丘腦弓狀核組織LEPR、KP、GPR54、GnRH蛋白表達水平 取液氮中下丘腦弓狀核組織，研缽內碾碎并轉移至放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液中，勻漿后以12 000g離心10 min取上清。統一蛋白濃度并變性蛋白，5%壓縮膠及12%濃度分離膠進行電泳（壓縮膠60 V，25 min；分離膠120 V，60 min），轉膜（200 mA，2 h），后將PVDF膜于5%脫脂乳中封閉2 h，一抗（均1∶500稀釋）4℃孵育過夜。次日洗膜，換液3～6次后，二抗（1∶8 000稀釋）孵育2 h；再洗膜并換液3～6次，電化學發光試劑（ECL）顯影，應用化學發光凝膠成像系統曝光并拍照記錄。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以蛋白LEPR、KP、GPR54、GnRH與內參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化情況比較表1結果顯示，正常組大鼠造模前、造模后及治療后體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與造模前比較，成模后模型組、電針組及西藥組大鼠體質量均顯著增加（P＜0.05），提示內分泌代謝紊亂導致肥胖發生。與成模后比較，模型組大鼠經非穴位點電針刺激后體質量無顯著性變化（P＞0.05），電針組及西藥組大鼠治療后體質量均顯著性降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量比較Table 1 Comparison of body mass among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠體質量比較Table 1 Comparison of body mass among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與造模前比較；②P＜0.05，與成模后比較

組別正常組模型組電針組西藥組鼠數/只15 15 15 15體質量/g造模前214.25±18.25 187.45±19.98 194.32±25.16 208.15±28.14成模后216.32±22.30 253.25±25.74①258.56±27.79①269.45±30.35①治療后211.14±23.72 249.12±27.56①217.64±24.25①②219.64±24.12①②F值1.383 33.561 23.873 20.822 P值0.262＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 各組大鼠卵巢質量及直徑比較表2結果顯示，4組間大鼠卵巢質量和直徑比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢質量及直徑均顯著增大（P＜0.05）；與模型組比較，電針組及西藥組大鼠卵巢質量及直徑均顯著減小（P＜0.05）；與電針組比較，西藥組大鼠卵巢質量及直徑顯著減小（P＜0.05）。

表2 各組大鼠卵巢質量及直徑比較Table 2 Comparison of mass and diameter of ovaries among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠卵巢質量及直徑比較Table 2 Comparison of mass and diameter of ovaries among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較

組別正常組模型組電針組西藥組F值P值鼠數/只15 15 15 15卵巢質量/g 0.09±0.01 0.15±0.03①0.13±0.02②0.11±0.02②③22.222＜0.001卵巢直徑/cm 0.45±0.05 0.56±0.07①0.51±0.06②0.47±0.04②③11.230＜0.001

2.3 各組大鼠卵巢組織病理形態比較圖1、表3結果顯示，正常組大鼠具有完整的卵巢組織結構，CL體積大且數目多，DF存在明顯較厚顆粒層；模型組大鼠卵巢組織結構不規則，見有多量薄層顆粒細胞的CF，提示卵巢多囊性病變；電針組及西藥組大鼠卵巢組織結構趨于正常，與模型組相比較，CF數目減少，CL和DF數目增多，卵泡顆粒層增厚，提示卵巢組織病理學異常及POCS得到改善。經測定各組大鼠CF、DF、CL數目，4組間大鼠卵巢組織CF、DF、CL數目比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠CF數目顯著增多，DF、CL數目顯著減少（均P＜0.05）；與模型組比較，電針組及西藥組CF數目顯著減少，DF、CL數目顯著增多（均P＜0.05）；與電針組比較，西藥組CF數目顯著減少，DF、CL數目顯著增多（均P＜0.05）。

圖1 各組大鼠卵巢組織HE染色結果（×400）Figure 1 HE staiting results of ovarian tissues in variousgroups of rats（×400）

表3 各組大鼠囊性卵泡（CF）、發育中卵泡（DF）、黃體（CL）數目比較Table 3 Comparison of the number of cystic follicles（CF），developing follicles（DF）and corpus luteum（CL）among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠囊性卵泡（CF）、發育中卵泡（DF）、黃體（CL）數目比較Table 3 Comparison of the number of cystic follicles（CF），developing follicles（DF）and corpus luteum（CL）among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較

組別正常組模型組電針組西藥組F值P值鼠數/只15 15 15 15 CF/個0.00±0.00 4.26±0.47①3.14±0.36②1.98±0.24②③486.719＜0.001 DF/個3.82±0.40 0.64±0.26①3.22±0.35②3.48±0.34②③272.467＜0.001 CL/個4.34±0.75 0.00±0.00①3.12±0.37②3.50±0.42②③246.394＜0.001

2.4 各組大鼠血清LEP、E2、T、LH及FSH水平比較表4結果顯示，4組間大鼠血清LEP、E2、T、LH及FSH水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較結果顯示：與正常組比較，模型組LEP、E2、T及LH水平顯著升高，FSH水平顯著降低（均P＜0.05）；與模型組比較，電針組及西藥組LEP、E2、T及LH水平顯著降低，FSH水平顯著升高（均P＜0.05）；與電針組比較，西藥組LEP、E2、T及LH水平顯著降低，FSH水平顯著升高（均P＜0.05）。

表4 各組大鼠血清瘦素（LEP）、雌二醇（E2）、睪酮（T）、促黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）水平比較Table 4 Comparison of serum leptin（LEP），estradiol（E2），testosterone（T），luteinizing hormone（LH），and follicle stimulating hormone（FSH）levels among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠血清瘦素（LEP）、雌二醇（E2）、睪酮（T）、促黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）水平比較Table 4 Comparison of serum leptin（LEP），estradiol（E2），testosterone（T），luteinizing hormone（LH），and follicle stimulating hormone（FSH）levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較

組別正常組模型組電針組西藥組F值P值鼠數/只15 15 15 15 LEP/（ng·mL-1）24.25±3.85 45.21±5.07①34.68±3.76②29.84±3.04②③74.319＜0.001 E2/（pg·mL-1）18.15±2.93 35.32±4.47①27.24±3.63②24.35±3.01②③60.022＜0.001 T/（ng·mL-1）38.48±6.87 85.22±10.39①68.44±7.68②54.26±6.16②③94.662＜0.001 LH/（mU·mL-1）17.26±3.19 28.25±4.15①23.18±3.35②19.36±2.17②③32.260＜0.001 FSH/（mU·mL-1）16.12±1.89 9.35±1.05①12.42±1.44②14.16±1.62②③52.789＜0.001

2.5 各組大鼠下丘腦弓狀核LEPR、KP、GPR54、GnRH蛋白表達比較圖2、表5結果顯示，4組間大鼠下丘腦弓狀核組織內LEPR、KP、GPR54及GnRH蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠下丘腦弓狀核組織內LEPR、KP、GPR54及GnRH蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組及西藥組大鼠LEPR、KP、GPR54及GnRH蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與電針組比較，西藥組大鼠LEPR、KP、GPR54及GnRH蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。表明電針可調節LEP/KP軸的活化狀態。

表5 各組大鼠下丘腦弓狀核組織內瘦素受體（LEPR）、親肽素（KP）、蛋白偶聯受體54（GPR54）、促性腺激素釋放激素（GnRH）蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of（LEPR），kisspeptin（KP），protein-coupled receptor 54（GPR54）and gonadotropin-releasing hormone（GnRH）in hypothalamic arcuate nucleus tissue among various groups of rats（±s）

表5 各組大鼠下丘腦弓狀核組織內瘦素受體（LEPR）、親肽素（KP）、蛋白偶聯受體54（GPR54）、促性腺激素釋放激素（GnRH）蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of（LEPR），kisspeptin（KP），protein-coupled receptor 54（GPR54）and gonadotropin-releasing hormone（GnRH）in hypothalamic arcuate nucleus tissue among various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較

組別正常組模型組電針組西藥組F值P值鼠數/只15 15 15 15 LEPR蛋白相對表達量0.08±0.02 0.34±0.04①0.28±0.03②0.23±0.02②③224.697＜0.001 KP蛋白相對表達量0.10±0.03 0.52±0.06①0.39±0.05②0.30±0.04②③217.384＜0.001 GPR54蛋白相對表達量0.12±0.03 0.45±0.05a①0.31±0.04②0.24±0.03②③193.220＜0.001 GnRH蛋白相對表達量0.09±0.03 0.38±0.06①0.29±0.04②0.11±0.04②③154.481＜0.001

圖2 各組大鼠下丘腦弓狀核瘦素受體（LEPR）、親肽素（KP）、蛋白偶聯受體54（GPR54）、促性腺激素釋放激素（GnRH）蛋白的Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blot electrophoresis bands of leptin receptor（LEPR），kisspeptin（KP），protein-coupled receptor 54（GPR54），and gonadotropin-releasing hormone（GnRH）proteins in hypothalamic arcuate nucleus among various groups of rats

3 討論

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種與性激素、生化因素和卵巢組織變化等有關的復雜內分泌代謝紊亂病，其中下丘腦-垂體-性腺軸激素分泌紊亂，雄性激素（如T）及LH水平升高是PCOS卵巢多囊、寡排卵/無排卵的一個明確病因[13]。PCOS患者中肥胖者居多[15]。本研究中，經DHEA誘導后，大鼠體質量顯著增加，提示肥胖發生；DHEA誘導大鼠卵巢質量及直徑顯著增大，且卵巢組織中CF數目顯著增多，CL和DF數目顯著降低，提示卵巢排卵功能障礙[16]；PCOS的重要診斷標準之一是性激素水平的改變，本研究中DHEA誘導大鼠血清E2、T及LH水平顯著升高，FSH水平顯著降低。綜合看來，DHEA可成功誘導構建PCOS大鼠模型。

在過去的20年中，二甲雙胍已被廣泛用于治療PCOS患者，尤其是代謝和生殖異常的患者，可增加排卵并降低血清睪酮水平，提高胰島素敏感性、緩解代謝紊亂和改善多囊癥狀[17]。故選擇二甲雙胍作為陽性對照藥物。《金匱要略·婦人雜病脈證并治》篇曰：“婦人之病，因虛、積冷、結氣，為諸經水斷絕。”腎虛、血瘀、肝郁是PCOS的主要病機，故針刺選穴治療以調理與現代醫學中下丘腦-垂體-性腺軸呈對應關系的“腎-天癸-沖任-胞宮軸”[18]為主，常選用三陰交、足三里、子宮、關元及中極穴作為治療PCOS的主穴。研究發現，三陰交、足三里穴與內分泌紊亂或生殖綜合征相關[19-20]。電針三陰交穴能夠在一定程度上提高機體內環境穩態，緩解雌激素分泌不足導致的機體下丘腦-垂體-卵巢軸紊亂，可有效促進卵泡的分裂、成熟和排出[21]；針刺足三里則可使沖脈氣血充盛，化生腎間動力，上下循行周身，是促成排卵的重要因素[22]。故本研究選擇雙側三陰交和足三里穴進行電針治療，并以二甲雙胍作為陽性對照藥物，結果顯示：與模型組比較，電針組大鼠體質量、卵巢質量及其直徑降低，CF數目減少，CL和DF數目升高，血清E2、T及LH水平下降，FSH水平上升；電針治療效果雖然低于二甲雙胍，但與其作用效果表現出一致性。提示電針可有效減輕PCOS大鼠的伴隨性肥胖，調節性激素水平，促進卵巢排卵功能障礙的恢復。

放大PCOS臨床嚴重程度的因素是肥胖[23]。PCOS患者同時伴有高胰島素血癥，而胰島素可增強LEP分泌[24]。研究發現，高瘦素血癥通過阻止卵泡發育直接影響卵巢生理[25]。KP是一組對下丘腦-垂體-性腺軸起調節作用的多肽激素，KP神經元是LEP影響促性腺激素分泌途徑的關鍵組成部分。KP受體GPR54的表達是功能性促性腺激素軸激活的關鍵條件，兩者結合后通過刺激GnRH神經元分泌性激素進而調控排卵[26]。本研究結果顯示，PCOS大鼠血清LEP水平顯著升高，提示PCOS大鼠合并高瘦素血癥；另PCOS大鼠下丘腦弓狀核中LEPR、KP、GPR54及GnRH蛋白表達水平顯著升高，提示PCOS大鼠LEP/KP軸處于激活狀態；經電針治療后，大鼠血清LEP水平及LEPR、KP、GPR54、GnRH蛋白表達水平均顯著降低，提示電針刺激可能通過抑制LEP/KP軸的激活進而調控PCOS大鼠的排卵。

綜上所述，電針可改善PCOS大鼠排卵功能障礙，調節性激素水平，其機制可能與其抑制LEP/KP軸、平衡機體內分泌紊亂有關。