漢黃芩苷抗糖尿病大鼠腎損傷及纖維化的機制研究

柯亞瓊，郝建波，蘆玲，陳淅泠，付艷芹

（1.鄭州大學第二附屬醫院老年醫學科二病區，河南鄭州 450000；2.鄭州大學第二附屬醫院內分泌科，河南鄭州 450000）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease）作為糖尿病的一種微血管并發癥，是終末期腎衰竭的主要原因，早期預防糖尿病腎臟損傷十分重要[1-3]。轉化生長因子β1（TGF-β1）是一種已知的促纖維化細胞因子。研究表明，臨床糖尿病腎病患者血清TGF-β1水平異常增高與蛋白尿程度密切相關[4]。TGF-β1/絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）信號通路激活可誘導急性腎損傷和腎纖維化，抑制該通路被認為是減輕腎臟損傷的途徑之一[5]。漢黃芩苷（wogonoside）為類黃酮單體，是中藥黃芩（為唇形科黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的根）的主要成分之一[6]，具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化[9]等藥理活性。既往有研究表明，漢黃芩苷可減輕糖尿病腎病腎組織炎癥[10]，提示漢黃芩苷對糖尿病并發腎組織損傷有治療作用。本研究擬建立糖尿病大鼠模型，進一步探討漢黃芩苷是否可通過抑制TGF-β1/p38MAPK信號通路發揮抗糖尿病大鼠腎損傷及纖維化的作用。又因細胞周期素依賴性蛋白激酶5（CDK5）與胰島β細胞損傷和胰島素分泌不足有關，Roscovitine作為CDK5的抑制劑，已被證實可通過抑制TGF-β1/p38MAPK途徑發揮抗糖尿病小鼠腎纖維化的作用[11]，故以Roscovitine治療為陽性對照。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級8周齡雄性SD大鼠50只，體質量為（180±20）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（魯）2019-0003。本研究方案已經鄭州大學第二附屬醫院倫理委員會審核通過（批號：ZZDXDEFSYY2019009）。研究過程遵循實驗動物人道主義及3R原則。飼養環境：24℃恒溫普通飼養，12 h/12 h光暗交替。

1.2 藥物、試劑與儀器漢黃芩苷（分子量：460.388；分子式：C22H20O11），純度≥98%，上海吉至生化科技有限公司生產，批號：51059-44-0。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、CDK5抑制劑Roscovitine（美國Sigma公司）；尿白蛋白（albumin，Alb）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海江萊生物技術有限公司）；α平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β1、Ⅳ型膠原蛋白（collagenⅣ，ColⅣ）、p38MAPK、GAPDH等抗體（美國Abcam公司）；磷酸化p38絲裂原活化蛋白酶（p-p38MAPK）抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（武漢艾美捷生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、馬松（Masson）三色染色試劑、ECL Plus超敏發光液試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。iBright成像系統[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；全自動生化分析儀（瑞士巴塞爾羅氏診斷公司）；多功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 造模、分組與給藥將50只大鼠適應性喂養1周后，根據隨機數字表取10只作為正常組常規飼養，剩余40只給予高脂飼料喂養6周后用于構建2型糖尿病模型。方法[12]：造模前禁食12 h，STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 4.0）中，每天腹腔單次注射30 mg/kg STZ（以枸櫞酸緩沖液稀釋），正常組腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。3 d后尾尖采血測定大鼠血糖，若隨機血糖濃度≥16.7 mmol/L，則判斷建模成功。繼續2周自由飲食飼養后，再次測量血糖證實糖尿病大鼠模型成功與否，期間無大鼠死亡。最后將造模成功的大鼠隨機分為4組，即模型組，漢黃芩苷低、高劑量組，Roscovitine對照組，每組10只。按照動物和人用藥劑量換算關系確定大鼠的等效劑量相當于人的6.17倍[13]，漢黃芩苷低、高劑量組分別給予漢黃芩苷[用二甲基亞砜（DMSO）溶解]10、40 mg·kg-1·d-1腹腔注射[10]，Roscovitine對照組給予Roscovitine（用DMSO溶解）40 mg·kg-1·d-1腹腔注射[11]，模型組和正常組腹腔注射等體積DMSO，連續給藥時間為10周。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 觀察大鼠一般狀態 包括精神狀態、毛色、飲食、排便、活動、體質量等。

1.4.2 標本采集與處理 末次干預后，將大鼠放置于單獨的代謝籠里，收集尿液，以檢測24 h尿Alb含量。后禁食12 h，經大鼠尾靜脈取血，檢測血糖值。后用戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心分離血清，用于空腹血糖與腎臟功能相關指標的測定。后處死大鼠，取出腎臟，統一將左腎置于4%的多聚甲醛中固定24 h用于組織學檢查，右腎保存于液氮內用于組織蛋白質的提取。

1.4.3 血糖和腎功能指標檢測 取血清，應用全自動生化分析儀測定大鼠空腹血糖（FBG）、血肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）。取尿液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠尿Alb水平。

1.4.4 腎組織病理學觀察 石蠟包埋的腎組織切片（4μm）經脫蠟、水化后，根據染色試劑盒說明書步驟進行常規HE染色和Masson染色，顯微鏡觀察并照相，評估腎小球硬化和腎小管間質病變。

1.4.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗 取液氮保存的腎臟組織，研缽碾碎后收集并加入預冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，混勻后離心，以12 000 g離心20 min，取上清。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白質濃度，統一濃度后進行蛋白變性。加樣，經十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），10%SDS凝膠上分離等量的蛋白（100μg）并轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，后將膜于5%脫脂乳中，37℃封閉2 h，于稀釋后的 一 抗ColⅣ、α-SMA、TGF-β1、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH（均1∶500稀釋）中4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜90 min（換液3～6次）后于25℃搖床孵育二抗（均1∶8 000稀釋）2 h，TBST洗膜90 min（換液3～6次），PVDF膜于暗處浸潤ECL顯影試劑2～3 min，利用化學發光凝膠成像系統拍照記錄。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，結果以目的蛋白與內參GAPDH的灰度值比值表示。

1.5 統計方法采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態比較給藥治療過程中，正常組大鼠精神狀態良好，飲食、排便無異常，活動自如，反應力良好，皮毛色澤自然；模型組大鼠表現出煩渴、多食和多尿的癥狀，消瘦，行動遲緩，精神狀態較差，皮毛色暗、毛糙無光澤；與模型組比較，漢黃芩苷低、高劑量組及Roscovitine對照組大鼠上述癥狀均明顯好轉。表明漢黃芩苷對糖尿病大鼠臨床癥狀具有一定的改善作用。

2.2 各組大鼠血糖和腎功能指標比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、高劑量組和Roscovitine對照組血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平顯著降低（P＜0.05）；漢黃芩苷低、高劑量組血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平均高于Roscovitine對照組，其中，漢黃芩苷高劑量組血清FBG和SCr水平的差異均無統計學意義（P＞0.05）。表明糖尿病大鼠模型存在腎功能損害，而漢黃芩苷可改善糖尿病大鼠血糖水平及腎功能損害。

表1 各組大鼠血糖和腎功能指標比較Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血糖和腎功能指標比較Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Roscovitine對照組比較

組別正常組模型組漢黃芩苷低劑量組漢黃芩苷高劑量組Roscovitine對照組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 FBG/（mmol·L-1）6.9±0.48 24.29±3.15①18.12±2.73②③9.46±1.91②8.34±1.29②166.702＜0.001 BUN/（mmol·L-1）9.37±0.65 26.24±3.87①19.75±2.06②③13.13±1.84②③11.39±1.20②133.939＜0.001 SCr/（μmol·L-1）25.15±2.63 80.65±6.78①61.26±4.12②③37.26±3.24②34.48±3.95②366.063＜0.001 Alb/（mg·L-1）5.87±0.37 26.14±3.12①19.15±2.67②③11.23±1.91②③9.17±1.12②210.420＜0.001

2.3 各組大鼠腎臟組織HE染色結果比較圖1結果顯示：正常組大鼠腎小球形狀規則、結構完整，腎小管上皮細胞排列整齊，腎臟無纖維組織增生及基底膜增厚，系膜細胞和基質無增殖；模型組出現了明顯腎間質損傷，可見炎癥細胞浸潤，腎小管管腔擴張，系膜基質增多，基底膜增厚，基底細胞增生；與模型組比較，漢黃芩苷低劑量組腎組織病理損傷改善輕微，而漢黃芩苷高劑量組腎組織病理損傷得到了較大程度的改善，且與Roscovitine對照組結果相似。表明糖尿病大鼠模型存在腎組織病理損傷，而漢黃芩苷可減輕糖尿病大鼠腎組織病理損傷。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結果比較（×200）Figure 1 Comparison of HE staining results of rat renal tissues among various groups（×200）

2.4 各組大鼠腎臟組織Masson染色結果比較圖2結果顯示：正常組大鼠腎組織基本正常，無膠原纖維藍色染色；模型組大鼠腎間質和腎小球的膠原纖維藍色染色較深，蛋白沉積顯著增加，腎纖維化嚴重；漢黃芩苷低、高劑量組及Roscovitine對照組大鼠腎小球及腎間質膠原纖維藍色染色較模型組變淺。表明糖尿病大鼠模型存在腎纖維化，而漢黃芩苷可減輕糖尿病大鼠腎纖維化。

圖2 各組大鼠腎組織Masson染色結果比較（×200）Figure 2 Comparison of Masson staining results of rat renal tissues among various groups（×200）

2.5 各組大鼠腎組織TGF-β1、p38MAPK、pp38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表達比較表2、圖3結果顯示：與正常組比較，模型組腎組織TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、高劑量組及Roscovitine對照組腎組織TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；漢黃芩苷低、高劑量組腎組織TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表達水平均高于Roscovitine對照組，其中，漢黃芩苷高劑量組的α-SMA及ColⅣ蛋白表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）。表明漢黃芩苷可抑制糖尿病大鼠腎組織纖維化相關蛋白的表達及TGF-β1/p38MAPK通路的活化。

表2 各組大鼠腎組織轉化生長因子β1（TGF-β1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）蛋白表達水平比較Table 2 Comparison of protein expression levels of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups （±s）

表2 各組大鼠腎組織轉化生長因子β1（TGF-β1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）蛋白表達水平比較Table 2 Comparison of protein expression levels of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Roscovitine對照組比較

組別正常組模型組漢黃芩苷低劑量組漢黃芩苷高劑量組Roscovitine對照組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 TGF-β1 0.18±0.02 1.15±0.11①0.96±0.10②③0.45±0.11②③0.36±0.08②285.308＜0.001 p38MAPK 0.21±0.02 1.21±0.21①0.91±0.08②③0.42±0.07②③0.35±0.06②204.559＜0.001 p-p38MAPK 0.17±0.03 1.12±0.13①0.87±0.07②③0.38±0.09②③0.32±0.06②322.456＜0.001 α-SMA 0.30±0.04 1.18±0.23①0.89±0.09②③0.39±0.10②0.37±0.08②130.284＜0.001 ColⅣ0.29±0.05 1.13±0.14①0.92±0.1②③0.38±0.07②0.37±0.08②227.323＜0.001

圖3 各組大鼠腎組織轉化生長因子β1（TGF-β1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）的Western Blot電泳條帶圖Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups

3 討論

病理條件下，糖尿病的高血糖啟動和激活一系列復雜過程，伴有大量細胞（包括間質成纖維細胞、內皮細胞、管狀細胞和周圍細胞）和肌母細胞活化產生的基質蛋白如纖維連接蛋白、層黏連蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ膠原蛋白等，可誘導糖尿病腎間質纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）[14]。TIF標志著不可逆性腎損傷，可作為腎臟生存期的最佳預測指標[11]，是各種腎臟疾病發展成為終末期腎衰竭的共同途徑。BUN、SCr和Alb水平是評估早期腎功能的重要指標，白蛋白尿則是糖尿病腎臟損傷中最典型的臨床癥狀之一。本研究結果顯示，糖尿病模型大鼠FBG及尿Alb含量顯著升高，提示成功建立糖尿病大鼠模型并伴有腎臟損傷；而經不同劑量漢黃芩苷及Roscovitine治療后，大鼠FBG及尿Alb含量均顯著降低，表明漢黃芩苷可有效改善糖尿病大鼠腎功能。漢黃芩苷為40 mg/kg劑量時具有與Roscovitine相似的療效。

糖尿病腎臟損傷的病理標志包括腎小球和腎小管基底膜的增厚、腎小球硬化及TIF[15]，其中，TIF為關鍵性病理過程，被認為是導致腎小球和腎小管功能障礙及衰退的主要病理因素[16]，表現為腎間質成纖維細胞的增多和細胞外基質（ECM）尤其是大量膠原纖維如ColⅣ的過度沉積[17]。α-SMA為肌成纖維細胞的標志性蛋白，其表達過量時，會促進腎纖維化病理過程[18]。TGF-β1是TGF-β超家族的成員，是通過調節ECM合成參與腎臟纖維化的重要因子[19]，可誘導腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞。另外，TGF-β1作為通路上游因子可激活p38MAPK信號，p-p38MAPK為p38MAPK通路 中的關鍵信號分子，其表達增強是該信號通路激活的標志之一[20]。本研究結果顯示，糖尿病模型大鼠腎臟組織發生明顯病理損傷，可見腎小球增大、炎癥細胞增多、基底膜彌漫性增厚、系膜處基質增多，腎纖維化程度嚴重，給予漢黃芩苷干預后，大鼠腎組織纖維化得到了明顯改善，表明漢黃芩苷具有抗糖尿病腎損傷及纖維化的作用。本研究結果還顯示，模型組腎組織TGF-β1及其下游信號因子p38MAPK的磷酸化水平和腎纖維化標志物α-SMA、ColⅣ均呈高表達，而漢黃芩苷低、高劑量組大鼠腎臟組織上述各分子指標表達水平均較模型組降低，且高劑量漢黃芩苷的治療效果更顯著，提示漢黃芩苷可能是通過抑制TGF-β1及其下游信號因子p38MAPK的活化，進而改善糖尿病大鼠腎纖維化。

綜上所述，漢黃芩苷可有效改善糖尿病大鼠腎損傷及纖維化，其機制可能與抑制TGF-β1/p38MAPK信號通路的活化有關。