基于“腸道菌群-腸-腦軸”探討半夏瀉心湯改善大鼠糖尿病認知功能障礙作用機制

徐歡，劉燕鳳，楊超茅，楊志新

（上海市寶山區中西醫結合醫院，上海 201900）

糖尿病認知功能障礙（diabetic cognitive dysfunction）是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）常見的中樞神經系統并發癥[1]，以學習記憶能力下降為主要表現，嚴重者可發展為癡呆，嚴重影響患者生活質量。數據統計顯示，我國糖尿病患者人數居世界首位[2]。尋找有效治療糖尿病認知功能障礙的藥物成為臨床研究的熱點。一般而言，糖尿病患者均存在不同程度的胃腸功能紊亂[3]，由于胃腸運動功能紊亂所致吸收的異常，及胃排空和腸道對食物的推動、吸收與血漿胰島素水平相互作用，常影響口服降糖藥物及其他藥物的療效，進而影響糖尿病的良好控制。中醫亦認為，脾胃虛弱、飲食壅滯是誘發糖尿病的重要因素。故從胃腸功能紊亂角度對其進行有效治療具有重要的意義。《傷寒論》經典方劑半夏瀉心湯具有寒熱平調、消痞散結、辛開苦降、補瀉同施、化痰行瘀的功效[4]，廣泛應用于功能性消化不良、膽汁反流性胃炎、胃食管反流病、消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎、胃癌及術后等消化道系統疾病的治療[5]。有學者研究[6-9]發現，半夏瀉心湯能改善大鼠胃腸動力障礙，調節腸道菌群，恢復腸道微生態穩態，可以有效調節血糖，改善胰島功能。而“腸道菌群-腸-腦軸”在神經、精神發育和胃腸道疾病的生物和生理學基礎研究領域中越來越受關注[10]。因此，本研究以此為切入點，通過構建糖尿病認知功能障礙大鼠模型，觀察半夏瀉心湯的干預作用及機制，以期為臨床應用半夏瀉心湯治療糖尿病認知功能障礙提供依據?，F將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只，4～6月齡，體質量180～220 g，購自長沙市天勤生物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2014-0010。大鼠統一飼養在SPF級動物室，保持室溫21～23℃，光照12 h/黑暗12 h循環晝夜交替。所有大鼠所用的飼料、水、墊料均經過嚴格滅菌處理，自由飲水攝食。動物實驗在本院進行。

1.2 試劑與儀器Aβ25-35、鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；微管相關蛋白輕鏈3（LC3）抗體、Beclin-1抗體（美國Abcam公司）；TRIzol試劑（美國Ambion公司）；cDNA逆轉錄試劑盒（美國Thermo Scientific公司）。RM2016病理切片機（上海萊卡儀器有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；光學顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 藥物及制備半夏瀉心湯，由半夏12 g、黃芩9 g、干姜9 g、人參9 g、炙甘草9 g、黃連3 g、大棗4枚組成，購于上海市寶山區中西醫結合醫院藥劑科。將中藥材浸泡在1 L蒸餾水中2 h，常規煎煮2次后，合并煎液，紗布過濾，加熱蒸發，直至煎液終濃度為1.7 g（生藥）/mL，置于無菌瓶中4℃環境保存。

1.4 分組、模型制備與給藥將60只大鼠隨機分為2組，空白組10只和實驗組50只。實驗組50只大鼠構建糖尿病認知功能障礙模型。方法[11]：給予大鼠高脂飼料（按質量分數配比：70%常規飼料、10%豬油、5%蛋白粉、0.5%膽固醇、10%蔗糖）喂養4周，第4周末的前1 d 17∶00開始禁食不禁水，第2天9∶00一次性腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，72 h后檢測空腹血糖?？崭寡侵怠?1.1 mmol/L者進入下一步實驗。將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，用微量注射泵將10μL Aβ25-35緩慢注入雙側海馬（以前鹵為原點，向后4.4 mm、旁開2.2 mm為穿刺點，自腦表面進針3.0 mm），若Morris水迷宮試驗逃避潛伏期延長、穿越目標區次數減少則判斷模型制備成功。空白組給予基礎飼料喂養，不予任何處理。

將造模成功的實驗組大鼠隨機分為5組，模型組，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組，每組10只。各組注射Aβ25-35前1周開始灌胃相應藥物。半夏瀉心湯低、中、高劑量組分別對應灌胃半夏瀉心湯煎液0.425、0.85、1.70 g·kg-1·d-1[12]，二甲雙胍組灌胃二甲雙胍0.30 g·kg-1·d-1[12]，模型組及空白組大鼠均灌胃等體積的生理鹽水。每日1次，連續28 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 空腹血糖變化 分別于造模前、造模后及給藥后，禁食12 h，大鼠尾靜脈采血，血糖儀測定空腹血糖。

1.5.2 Morris水迷宮試驗 給藥第23天開始進行訓練。前4 d給予常規訓練，每日1次。定位航行能力檢測：于直徑250 cm、高度50 cm，水深25 cm、水溫20℃的圓形水池內進行測試。將水池劃分為4個象限，于中央設置一個圓臺，分別從迷宮的4個象限將大鼠背對隱藏在水面下的平臺放入水中，記錄大鼠90 s尋找到水下平臺所需的時間，即為大鼠逃避潛伏期。若大鼠找不到平臺，將大鼠重新引至平臺，記錄逃避潛伏期為90 s。第5天測試大鼠從第3象限找到平臺的時間為最終數據?？臻g探索能力檢測：定位航行能力檢測后將中央平臺取出，記錄大鼠90 s內于目標象限內的滯留時間。

1.5.3 流式細胞術檢測血清T淋巴細胞亞群 給藥結束后麻醉大鼠，腹主動脈取血3 mL，室溫靜置2 h，4℃環境以3 000 r/min（離心半徑4.5 cm）離心5 min，分離血清，流式細胞儀檢測血清中CD8+T淋巴細胞比例、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+比值。

1.5.4 蛋白質免疫印跡（Western Blot）法檢測腦組織自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達 取大鼠腦組織，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解腦組織，離心收集上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量測試盒檢測總蛋白濃度。每孔上樣8μg總蛋白樣品，經5%～17%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯胺凝膠電泳（PAGE）后，轉聚偏氟乙烯（PVDF）膜，繼用5%脫脂奶粉封閉2 h，用LC3、Beclin-1、β-actin一抗稀釋液（均為1∶1 000）室溫孵育2 h，辣根過氧化物酶標記的IgG二抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育1 h。按照電化學發光（ECL）試劑盒說明書操作，將發光液均勻滴在PVDF膜上，反應1 min，最后將膜放入暗室壓片成像。用Quantity One軟件對顯影條帶進行分析，結果用目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值表示。

1.5.5 腸道菌群16S-rDNA測序 提尾反射法留取大鼠糞便。樣本進行基因組DNA抽提，所得DNA經Qu-bit 2.0熒光計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳質檢。質控標準：電泳時必須有1條大于10 kb的主帶，并且主帶下無明顯彌散帶/無降解。將質檢合格的DNA按照MiSeq測序系統使用說明書準備測序試劑。將所提取到的DNA于-80℃保存。前引物序列：5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’；后引物序列：5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。將得到的PCR產物構建測定文庫，采用Illumina MiSeq平臺測序，對高通量測序數據進行生物信息學分析，該部分由上海銳翌生物科技有限公司完成。根據各樣本生成的操作分類單元（OTU）數，對樣本序列隨機抽樣，以抽取的序列數及該序列所代表的OTU數構建曲線，計算樣本的α多樣性，屬于α多樣性分析。其中，Chao 1指數和Shannon指數是反映物種豐富度的指標。并采用Beta多樣性分析中Metastats分析方法，檢測客觀宏基因組樣本的差異豐度特征，找出2個樣本組中具有顯著差異的微生物類型。

1.5.6 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測腦組織中蛋白激酶A（PKA）、環腺苷酸（cAMP）反應元件結合蛋白（CREB）mRNA表達 取大鼠100 mg腦組織加入1 mL TRIzol，用小剪刀將其剪碎，利用勻漿器將腦組織充分均漿，依照RNA提取試劑盒步驟提取腦組織總RNA，通過微量紫外分析儀檢測總RNA濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。取16μL總RNA聯合逆轉錄試劑盒試劑形成40μL體系逆轉錄為cDNA。以完整逆轉cDNA為模板，按照SYBR Green Realtime PCR Maeter Mix說明書加入相關試劑及引物最終成為20μL體系進行PCR擴增。PKA上游引物序列為5’-TTTGCCAAGCGTGTGAAAGGG-3’，下游引物序列為5’-GGATAATCTCGGGGGCCAAG-3’，擴增片段長度339 bp；CREB上游引物序列為5’-GT ATCCATGCCAGCAGCTCA-3’，下游引物序列為5’-CATGGACCTGGACTGTCTGC-3’，擴增片段長度392 bp；GAPDH上游引物序列為5’-ACAGCAAC AGGGTGGTGGAC-3’，GAPDH下游引物序列為5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’，擴增片段長度413 bp。具體反應條件：預變性95℃2 min；變性95℃15 s，退火61℃30 s，延伸72℃15 s，40個循環。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法分析目的基因的相對表達量。

1.6 統計方法采用Graphpad Priam 8.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖比較表1結果顯示：造模前，各組大鼠空腹血糖比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，模型組，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠空腹血糖值較空白組均升高（P＜0.05）。給藥干預后，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠空腹血糖均低于模型組（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組大鼠空腹血糖與二甲雙胍組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點空腹血糖比較Table 1 Comparison of fasting blood glucose among various groups of rats at different time points （±s）

表1 各組大鼠不同時間點空腹血糖比較Table 1 Comparison of fasting blood glucose among various groups of rats at different time points （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與二甲雙胍組比較

組別空白組模型組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組二甲雙胍組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10空腹血糖/（mmol·L-1）造模前5.12±1.01 5.23±1.03 5.18±1.02 5.10±1.03 5.08±1.04 5.21±1.02 0.036 42 0.999 20造模后5.01±1.02 24.63±3.45①25.72±3.51①25.01±3.62①24.88±3.73①24.71±4.01①57.79＜0.000 1給藥后5.08±1.05 23.15±3.12①20.02±2.87①②③16.27±2.31①②③7.36±1.28①②7.23±1.24①②126.4＜0.000 1

2.2 各組大鼠Morris水迷宮試驗結果比較表2結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越目標區次數明顯減少（P＜0.05）；半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠逃避潛伏期均短于模型組，穿越目標區次數高于模型組（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組逃避潛伏期和穿越目標區次數與二甲雙胍組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越目標區次數比較Table 2 Comparison of escape latency and frequency of crossing the target area among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越目標區次數比較Table 2 Comparison of escape latency and frequency of crossing the target area among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與二甲雙胍組比較

組別空白組模型組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組二甲雙胍組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10逃避潛伏期/s 12.01±2.18 35.26±5.24①30.42±4.06①②③23.67±3.56①②③14.25±2.67①②14.83±2.75①②72.84＜0.0001穿越目標區次數/次8.13±1.25 2.05±0.73①3.46±0.82①②③5.27±0.96①②③7.05±1.10①②7.08±1.11①②54.67＜0.0001

2.3 各組大鼠血清中CD4+、CD8+T細胞比例及CD4+/CD8+比值表達比較表3結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清中CD8+T細胞比例升高，CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著降低（P＜0.05）；半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清中CD8+T細胞比例低于模型組，CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+比值均高于模型組（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組大鼠血清中CD8+T細胞比例、CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+比值與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清中CD4+、CD8+T細胞比例及CD4+/CD8+比值表達比較Table 3 Comparison of the proportion of CD4+，CD8+T cells in serum and the ratio of CD4+/CD8+among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠血清中CD4+、CD8+T細胞比例及CD4+/CD8+比值表達比較Table 3 Comparison of the proportion of CD4+，CD8+T cells in serum and the ratio of CD4+/CD8+among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與二甲雙胍組比較

組別空白組模型組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組二甲雙胍組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 CD8+T細胞比例/%24.31±2.43 38.26±3.81①35.18±3.42①②③31.42±3.15①②③28.01±2.73①②27.89±2.67①②28.31＜0.000 1 CD4+T細胞比例/%23.08±2.36 15.31±1.72①17.26±1.93①②③19.36±2.01①②③21.58±2.18①②21.37±2.15①②20.14＜0.000 1 CD4+/CD8+比值0.85±0.23 0.42±0.12①0.56±0.16①②③0.62±0.18①②③0.73±0.21①②0.75±0.22①②6.510＜0.000 1

2.4各組大鼠腦組織自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達比較圖1結果顯示：與空白組比較，模型組LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表達水平均低于模型組（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表達水平與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達比較Figure 1 Comparison of the expression of autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1 among various groups of rats（±s）

2.5 各組大鼠腸道菌群多樣性分析結果比較表4結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠腸道菌群多樣性分析中的Chao 1指數和Shannon指數均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組Chao 1指數和Shannon指數均不同程度增加（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組Chao 1指數和Shannon指數與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠Chao 1指數和Shannon指數比較Table 4 Comparison of Chao 1 index and Shannon index among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠Chao 1指數和Shannon指數比較Table 4 Comparison of Chao 1 index and Shannon index among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與二甲雙胍組比較

組別空白組模型組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組二甲雙胍組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 Chao 1指數511.42±65.18 372.15±102.47①415.38±93.24①②③486.27±81.05①②③542.36±68.31①②536.29±69.15①②7.252＜0.0001 Shannon指數5.61±0.81 4.23±0.45①4.87±0.61①②③5.25±0.83①②③6.31±1.02①②6.45±1.03①②10.83＜0.0001

2.6 各組大鼠菌落的群落結構比較圖2-A結果顯示：門水平上，與空白組比較，模型組的厚壁菌門（Firmicutes）豐度顯著降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度顯著增加，厚壁菌門/擬桿菌門的比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組厚壁菌門豐度均不同程度增加，擬桿菌門豐度不同程度降低，厚壁菌門/擬桿菌門的比值增加（P＜0.05）。

圖2-B結果顯示：屬水平上，模型組普氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）豐度高于空白組，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、密螺旋體屬（Treponema）豐度低于空白組（P＜0.05）；半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組普氏菌屬、瘤胃球菌屬豐度低于模型組，乳酸桿菌屬、密螺旋體屬豐度高于模型組（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組普氏菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌屬、密螺旋體屬豐度與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠菌落的群落結構比較Figure 2 Comparison of community structure of bacterial colony among various groups of rats

2.7 各組大鼠腦組織中PKA、CREB mRNA表達比較圖3結果顯示：模型組PKA、CREB mRNA表達水平低于空白組（P＜0.05）；半夏瀉心湯低、中、高劑量組和二甲雙胍組中PKA、CREB mRNA表達水平高于模型組（P＜0.05），且半夏瀉心湯各組呈劑量依賴性；半夏瀉心湯高劑量組PKA、CREB mRNA表達水平與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織中PKA、CREB mRNA表達比較Figure 3 Comparison of mRNA expression of PKA and CREB in brain tissues among various groups of rats

3 討論

近年來，腸道菌群和中樞神經系統疾病的關系逐漸成為科學領域研究的熱點，并提出了腸道與大腦之間存在“腸道菌群-腸-腦軸”。腸道菌群可通過迷走神經、內分泌等途徑參與中樞神經系統進行交流，從而影響大腦功能和行為；反之，大腦也可以通過迷走神經等多種途徑影響腸道菌群[13]。而腸道菌群與2型糖尿病等代謝性疾病發病密切相關。有研究表明，糖尿病潛在機制與腸道菌群豐度和多樣性的變化有關[8]。故推測，腸道菌群-腸-腦軸可能是研究糖尿病認知功能障礙機制及干預作用的有效切入點。因此，本研究基于腸道菌群-腸-腦軸探討半夏瀉心湯對糖尿病認知功能障礙大鼠的影響。

半夏瀉心湯主治寒熱錯雜之痞證，其辛開苦降的配伍思想順應了脾胃的生理特性，通過調節脾胃氣機升降而恢復脾胃功能，使機體的物質代謝恢復正常。半夏瀉心湯是助脾散精法的代表方劑之一，其中：半夏可辛溫散熱；黃芩、黃連苦寒清降；人參、大棗、炙甘草等合用以恢復中焦氣機合暢，收聚離經之精。全方升降同用，甘苦同施，達到助脾與散精兼顧[14]。本研究結果表明，糖尿病認知功能障礙大鼠有較嚴重的菌群失調、免疫功能下降，半夏瀉心湯能改善糖尿病認知功能障礙大鼠腸道微生態環境，促進益生菌的增殖，減少致病菌水平，并能提高機體免疫功能（增加血清CD8+T細胞比例，降低CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+比值）。

Morris水迷宮試驗是較為公認的神經認知功能和記憶改善治療效果評估手段之一[15]。本研究結果顯示，模型組大鼠Morris水迷宮試驗逃避潛伏期增加，穿越目標區次數減少，而經半夏瀉心湯干預后大鼠的逃避潛伏期縮短，穿越目標區次數增多，表明半夏瀉心湯可提高糖尿病認知功能障礙大鼠記憶能力，改善認知功能障礙癥狀，且與二甲雙胍效果相當。

細胞自噬在認知功能障礙機制中發揮重要作用。研究表明，神經元自噬異常會破壞細胞穩態，嚴重時可影響患者的認知功能；而通過調控神經細胞自噬信號通路可明顯改善細胞缺氧，促進能量及物質代謝，改善認知功能[16]。既往研究發現，糖尿病小鼠海馬神經元自噬增強[17]。自噬對應激狀態下神經細胞存活、清除神經細胞內衰老細胞器和錯誤折疊蛋白等起重要作用；其可作為神經細胞的保護機制，也可作為神經細胞死亡方式之一[18]。本研究結果表明，半夏瀉心湯可抑制糖尿病認知功能障礙大鼠神經細胞自噬的過度激活（下調腦組織自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表達），保護神經細胞功能。

蛋白激酶A（PKA）-環腺苷酸（cAMP）反應元件結合蛋白（CREB）信號轉導通路在中樞神經系統中起關鍵作用，能促進神經細胞的再生和分化[19]。又有研究證實，PKA-CREB信號通路介導突觸的可塑性和學習記憶功能。cAMP作為細胞內第二信使，通過活化PKA激活CERB，CREB激活后與環磷腺苷效應元件（CRE）結合，進而調節下游基因的轉錄，廣泛參與神經系統的學習記憶過程[20]。CREB的活性對維持神經功能至關重要，其可調節突觸可塑性、長期記憶的形成和神經元存活[21]。本研究結果表明，半夏瀉心湯可能通過增強糖尿病認知功能障礙大鼠腦組織中PKA、CREB的基因表達，影響了海馬突觸可塑性，從而改善糖尿病大鼠認知功能。

綜上所述，半夏瀉心湯可改善大鼠糖尿病認知功能障礙，其機制可能與調節腸道菌群，增強細胞免疫功能，并抑制神經細胞自噬、激活腦組織PKA-CREB信號通路進而保護神經功能有關。