培土生金法對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡、膈肌及其線粒體病理形態的影響

馮立志，詹少鋒

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院心肺康復科，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東廣州 510405）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），是一種常見的呼吸疾病，以氣流受限不完全可逆為特征[1]。COPD主要由于氣道炎癥和黏液纖毛功能障礙，產生氣流受限，引起肺功能明顯下降，臨床主要表現為咳、痰、悶、喘，隨著病情加重，逐漸表現為呼吸困難，最終導致活動能力明顯下降[2-4]。COPD患者多存在嚴重的呼吸肌疲勞，這是導致COPD病情逐漸加重，甚至死亡的重要原因之一。如何減少COPD患者呼吸衰竭，增強呼吸肌和膈肌的力量，促進患者康復，成為醫學難題。

中醫藥治療COPD不僅可以緩解癥狀，提高臨床療效，縮短住院天數和降低死亡率，而且可以進一步改善患者的生存質量，控制疾病發展，具有良好的應用前景。本研究團隊前期相關COPD的研究發現：培土生金法聯合西藥能改善COPD穩定期外周骨骼肌功能障礙患者的臨床癥狀，提高療效[5]；培土生金法可改善COPD大鼠肺功能，上調血漿細胞色素C氧化酶（ROC）和神經生長因子（NGF）水平，促進線粒體的氧化代謝[6]。提示培土生金法具有提升肌力，改善線粒體能量代謝，提升肺通氣功能的作用。COPD與呼吸肌疲勞密切相關。本研究擬觀察培土生金法對COPD大鼠肺、膈肌及其線粒體病理形態的影響，探討培土生金法對呼吸肌的保護作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物48只SPF級5～7周齡雄性SD大鼠，體質量100～140 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0034。動物飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，于12 h光明/12 h黑暗，溫度控制在20～26℃，濕度在40%～70%的SPF級別環境中，自由飲水和攝食。適應性飼養1周后開始進行動物實驗。實驗期間使用的滅菌普通飼料由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物、試劑與儀器地塞米松片（Sigma上海貿易有限公司，批號：D4902）；五指毛桃（金源綠色生命中藥飲片有限公司，批號：191102）；太子參（廣東至信中藥飲片有限公司，批號：191102）；茯苓（廣東天誠中藥飲片有限公司，批號：190501）；苦杏仁、白術、紫蘇子（廣東紫和堂大藥房有限公司，批號：191207、1912140、1909062）。蘇木素染液、伊紅染液（谷歌生物公司）；無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）。H-7600透射電子顯微鏡（Hitachi日立公司）；Nikon DS-U3成像系統、光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 方藥組成及制備培土生金法中藥復方由五指毛桃24 g、太子參16 g、茯苓12 g、白術9.6 g、苦杏仁8 g、紫蘇子8 g組成。中藥煎劑制作過程如下：將上方中藥材置于8倍溫水中浸泡0.5 h，煮沸后文火煎煮4 h，注意均勻攪拌，取汁后經三層紗布過濾；第2次和第3次煎煮均分別以6倍水文火煎煮2 h，同樣方法取汁。合并3次藥液。根據臨床每日成人用藥量換算成大鼠用藥劑量[7]。濃縮至每毫升含1.8 g（生藥）/kg（體質量）作為給藥高劑量，稀釋2倍后為0.9 g（生藥）/kg（體質量）作為給藥中劑量，稀釋4倍后為0.45 g（生藥）/kg（體質量）作為給藥低劑量。藥液常溫冷卻后，至4℃冰箱內保存備用。

1.4 分組、造模與給藥將48只大鼠隨機分成6組，即空白組，模型組，中藥高、中、低劑量組和陽性藥物組，每組各8只。采用熏吸香煙的造模方法，建立COPD模型[8]。具體方法如下：將大鼠置于自制密閉造模箱（大小50 cm×50 cm×50 cm，木質箱體，透明有機玻璃箱蓋，箱體壁留有4個直徑1 cm通氣孔）內，注入香煙煙霧，30 min/d，整個造模時間為28 d。預取材時觀察肺組織病理，發現肺大泡形成提示造模成功[9]。成功造模后分組給藥。中藥高、中、低劑量組：分別對應給予1.8、0.9、0.45 g（生藥）/kg（體質量）培土生金法中藥復方灌胃，每天1次；陽性藥物組：給予地塞米松0.2 mg/kg灌胃，每天1次；空白組：常規喂養，給予生理鹽水灌胃，每天1次，不作其他干預；模型組：給予生理鹽水灌胃，每天1次。給藥時間共為30 d。禁食12 h，行肺和膈肌組織檢測。

1.5 HE染色法觀察肺和膈肌組織病理變化①取材：頸椎脫臼處死大鼠后，取出肺和膈肌組織，清洗，濾紙吸干，放入組織固定液中24 h以上。②脫水：75%乙醇4 h-85%乙醇2 h-90%乙醇2 h-95%乙醇1 h-無水乙醇Ⅰ30 min-無水乙醇Ⅱ30 min-50%無水乙醇、50%二甲苯混合液5～10 min-二甲苯I 5～10 min-二甲苯Ⅱ5～10 min-石蠟Ⅰ1 h-石蠟Ⅱ1 h-石蠟Ⅲ1 h。③包埋：將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋。④切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm。⑤石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ10 min-無水乙醇Ⅱ10 min-95%乙醇5 min-90%乙醇5 min-80%乙醇5 min-70%乙醇5 min-蒸餾水洗。⑥蘇木素染細胞核：切片入Harris蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。⑦伊紅染細胞質：切片入伊紅染液中染色1～3 min。⑧脫水封片：將切片依次放入95%乙醇I 5 min-95%乙醇Ⅱ5 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

1.6 肺泡面積分析采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對肺組織HE染色圖片肺泡面積進行測量，并進行統計分析。

1.7 電鏡觀察膈肌超微結構①取材：組織塊1～2 mm3。②固定：沖液配制固定2 h或更長時間。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸固定液固定2～3 h，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。③脫水：50%乙醇15～20 min，70%乙醇15～20 min，90%乙醇15～20 min，90%乙醇90%丙酮（1∶1）15～20 min。90%丙酮15～20 min以上在4℃冰箱內進行，100%丙酮室溫3次，每次15～20 min。④包埋聚合：將浸透后的標本放入包埋膠囊的純樹脂中，70℃12 h。⑤固化：37℃烘箱內過夜，45℃烘箱內12 h，60℃烘箱內48 h。⑥Leica UC 7超薄切片機切片60 nm超薄片。⑦醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色。⑧Hitachi日立H-7600透射電子顯微鏡觀察，拍片。

1.8 統計方法采用Image-Pro Plus圖像分析軟件和SPSS 19.0統計軟件分析。所得數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊，組間兩兩比較采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化比較圖1和表1結果顯示：空白組肺組織結構清晰，肺泡結構完整，未見明顯肺大泡。與空白組比較，模型組的肺組織結構出現明顯破壞，肺大泡明顯，肺泡周圍伴有炎癥細胞浸潤。中藥各劑量組和陽性藥物組的肺組織破壞程度較模型組減輕，肺泡結構基本完整，周圍炎癥細胞浸潤不明顯，肺泡腔縮小。提示培土生金法中藥復方可保護COPD大鼠肺組織結構，減少肺大泡的形成及炎癥滲出。

表1 各組大鼠肺泡面積比較Table 1 Comparison of rat pulmonary alveoli area among various groups （±s）

表1 各組大鼠肺泡面積比較Table 1 Comparison of rat pulmonary alveoli area among various groups （±s）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組陽性藥物組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組鼠數/只888888肺泡面積/μm2 101.63±29.98 251.14±27.81①112.79±18.73②117.85±26.93②126.12±29.30②138.54±29.95②

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色法）Figure 1 Comparison of the histopathological changes in rat lung tissue among various groups（by HE staining method）

2.2 各組大鼠膈肌病理變化比較圖2結果顯示，空白組的膈肌組織結構正常，肌纖維紋理清晰，肌細胞排列整齊，間隙正常。與空白組比較，模型組的膈肌組織結構明顯破壞，肌纖維紋理紊亂，間隙增大，肌細胞排列不齊。中藥各劑量組和陽性藥物組的膈肌組織結構大致相似，膈肌纖維紋理整齊有序，間隙正常，可見排列整齊的肌細胞。提示培土生金法中藥復方可保護COPD大鼠膈肌組織結構，減少其膈肌肌絲和肌細胞的破壞。

圖2 各組大鼠膈肌病理變化比較（HE染色法）Figure 2 Comparison of pathological changes in the rat diaphragm among various groups（by HE staining method）

2.3 各組大鼠膈肌超微結構比較圖3結果顯示，空白組肌原纖維排列有序，粗細絲的結構清晰，存在明暗相間的橫紋帶，可見深密度的Z線及H帶。另外，在肌原纖維中可見排列整齊的線粒體和糖原顆粒等結構。與空白組比較，模型組的膈肌組織結構明顯破壞，肌纖維粗大無序，間隙增大，肌細胞排列紊亂，線粒體缺失破壞，分布明顯不均勻。中藥各劑量組和陽性藥物組的膈肌組織結構大致相似，肌纖維排列有序，走行清晰，間隙正常，可見較多完整的線粒體結構。提示培土生金法中藥復方可減輕COPD大鼠膈肌組織和線粒體結構的損傷，對膈肌肌絲和線粒體具有明顯的保護作用。

圖3 各組大鼠膈肌超微結構比較（透射電鏡）Figure 3 Comparison of the ultrastructure of the rat diaphragm among various groups（by transmission electron microscopy）

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）歸屬中醫學“肺脹”范疇，病位主要在肺，涉及五臟六腑，其中又以肺脾關系最為密切。中醫學認為：肺主氣，司呼吸；脾主運化升清。脾通過運化功能，輸送水谷精微到全身各組織中，發揮滋潤肺組織和膈肌的作用，同時排出代謝水液到體外，從而維持水液的平衡。那么，健脾培土，補土生金，可加強肺主氣功能。本研究結果顯示，中藥各劑量組和地塞米松陽性藥物組肺組織病理表現相似，與模型組相比，肺組織結構均明顯好轉，肺大泡明顯減少，肺組織無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡基本完整，提示中藥培土生金法能夠保護COPD大鼠肺組織結構，進而改善肺通氣功能，減輕呼吸受阻的癥狀。

COPD患者往往對呼吸肌的需求增加，呼吸肌的功能儲備亦顯著降低。膈肌是參與呼吸過程的主要呼吸肌，若膈肌功能異常，會影響正常的呼吸功能，嚴重的可出現呼吸衰竭，甚至死亡。中醫學認為：脾主肌肉。脾通過運化功能可以保持膈肌豐滿潤澤，增強膈肌收縮力。張立德等[10]以“脾主肌肉”為依據，發現脾氣虛家兔肌電圖的單位電位波形多為五相以上，波幅降低，時程增大。經健脾治療后，可讓肌肉電波恢復到正常狀態[11]。還有研究表明，骨骼肌細胞能量代謝與線粒體密切相關[12]。線粒體是氧化代謝的核心，骨骼肌所需的能量與線粒體的質量密切相關[13]。李樂紅等研究[14]發現，脾氣虛動物模型體內的骨骼肌線粒體質量發生異常改變，經健脾益氣類藥物治療后，其結構可以恢復到接近正常的狀態，提示健脾益氣類藥物具有修復線粒體功能的作用。由此可見，脾-線粒體-肌肉三者關系密切，相互影響。通過益氣健脾，提升肌細胞線粒體的質量，直接達到增強肌肉的作用，從而改善呼吸功能[1 5]。本研究結果顯示：與空白組相比較，模型組的膈肌組織結構明顯破壞，肌纖維粗大無序，間隙增大，肌細胞排列紊亂，線粒體缺失破壞，而中藥各劑量組和地塞米松陽性藥物組膈肌超微結構表現相似，與模型組相比，肌纖維整齊有序，無明顯斷裂或變形，肌細胞和線粒體結構完整。結果表明，中藥培土生金法可修復C O P D大鼠膈肌組織結構和受損線粒體，進而增強膈肌舒縮功能，提高呼吸功能。

綜上所述，通過觀察培土生金法對COPD大鼠肺泡、膈肌和線粒體病理變化的影響，驗證了培土生金法能改善COPD疾病過程中肺泡、膈肌和線粒體損傷，提示培土生金法具有改善呼吸肌疲勞的作用。此作用機制為培土生金法緩解呼吸肌疲勞，減少發生呼吸衰竭在臨床的實際應用提供了科學依據。