減味二藤湯對宮腔機械性損傷大鼠子宮內膜基質細胞過氧化物酶體增殖物激活受體α/脂肪酸氧化信號通路的影響

胡昀昀，應翩，楊華娣，張瑜芯，姚志韜

（1.浙江省中醫藥大學附屬第一醫院，浙江杭州 310006；2.浙江中醫藥大學，浙江杭州 310006）

宮腔機械性損傷所致的宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是由于子宮內膜基底層損傷后繼發肌壁間粘連，導致宮頸管、子宮部分或全部閉塞，引起月經異常、腹痛、不孕等癥狀的疾病[1]。據報道，25%～30%[1]女性在多次人工流產、刮宮后均可出現宮腔粘連，其中僅22.5%～33.3%[2]可出現再次妊娠，嚴重影響女性的生殖健康。減味二藤湯是本課題組在國家級名老中醫裘笑梅經驗方二藤湯的基礎上化裁而成，對腎虛為本、瘀熱互結引起的盆腔感染、月經異常有確切療效[3]。前期臨床研究發現，減味二藤湯能減輕中重度宮腔粘連分離術后患者的月經情況及妊娠結局[4-5]，但該方的具體作用機制尚不明確。子宮內膜纖維化是宮腔粘連的主要病理學特征，是其本質[6-7]。近年來研究發現，胞內脂質累積出現脂毒性，可導致各類重要器官纖維化，如肝纖維化、腎纖維化等[8-9]，其中，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）調控的脂肪酸氧化（FAO）是細胞纖維化的關鍵途徑[10-11]。那么，減味二藤湯是否可以通過激活PPAR-α/FAO信號通路、誘導脂肪酸氧化來達到抑制宮腔機械性損傷大鼠的子宮內膜纖維化進程？基于此，本課題組擬通過觀察減味二藤湯對宮腔機械性損傷大鼠子宮內膜基質細胞（ESCs）中PPAR-α/FAO相關蛋白的影響，探討其可能的干預機制，以期為中醫證治宮腔機械性損傷導致的宮腔粘連纖維化提供新的依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPF級8周齡雌性SD大鼠，8周齡雄性Wistar大鼠，體質量（220±20）g，各10只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，飼養室溫控制在22～24℃，相對濕度40%～70%，自由飲食、飲水，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。

1.2 試劑與儀器PPAR-α抑制劑GW6471（美國Sigma公司）；DMEM/F12培養液及胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8，碧云天生物技術有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、I型膠原蛋白（Collagen I）抗體、纖連蛋白（Fibronectin）抗體、PPAR-α抗體、?；o酶A氧化酶1（ACOX1）抗體、肉毒堿棕櫚?；D移酶1A（CPT1A）抗體（美國Abcam公司）；GAPDH抗體（杭州賢至生物有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠親和免疫球蛋白（IgG）（H+L）二抗、HRP標記山羊親和抗兔IgG（H+L）二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。IX51倒置熒光顯微鏡（美國Leica公司）；SW-CJ-1FD無菌操作臺（蘇州凈化設備有限公司）；臺式低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；電泳儀、垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.3 藥物及制備減味二藤湯由紅藤20 g、忍冬藤20 g、威靈仙15 g、菟絲子10 g、牡丹皮5 g組成，以上中藥飲片購自浙江省中醫院中藥房。取藥材按8倍比例加水，浸泡20 min，文火煎煮40 min，用紗布濾凈再加8倍水，文火煎煮30 min，紗布過濾，合并濾液，濃縮定容至100 mL，其原液質量濃度為0.7 g/mL。放入玻璃瓶中，密封，標記，冷藏。

1.4 實驗動物模型建立及分組采用機械性損傷法建立宮腔粘連大鼠模型[12]。將10只性成熟未交配的雌性SD大鼠，適應性喂養1周。于每日8∶00、16∶00行陰道涂片，顯微鏡下觀察陰道上皮細胞的形態，確定大鼠動情周期。取動情期SD大鼠建模，隨機選擇5只大鼠（右側子宮）作為模型組，另5只大鼠作為正常組。方法：術前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，將大鼠仰臥位固定在手術板上，碘伏消毒，于下腹部正中做一長為2～3 cm的縱行切口，進入腹腔，暴露“V”形子宮。于右側子宮中上1/3處剪開一直徑2 mm縱切口，使用直徑2 mm刮匙上下刮取子宮內膜組織。刮宮時可用指腹捏住子宮，感知刮宮程度，防止刮穿子宮肌層，子宮壁菲薄半透明時停止刮宮，采用可吸收線縫合切口，逐層關腹。術后肌肉注射青霉素鈉200 U·g-1，連續3 d，預防感染。術后每日觀察大鼠的精神狀態、飲食、排便及體質量情況。于造模后14 d取樣分離細胞。

1.5 細胞的分離、體外培養正常大鼠ESCs來源于正常組8周齡正常動情期雌性SD大鼠的子宮內膜組織，纖維化ESCs來源于模型組刮宮之后的雌性SD大鼠子宮內膜組織。收集的子宮內膜組織，采用預冷的HBSS清洗3次后，剔除血塊及黏液，將子宮內膜組織剪成0.5～1 mm3大小的碎塊，離心去除上清液，向組織沉淀中加入0.8 mg·mL-1的Ⅰ型膠原酶，37℃、5%CO2培養箱中消化約60 min，每15 min震蕩1次。采用DMEM/F12培養液+10%FBS培養液終止消化，移液器吹散組織塊，吸取細胞懸液，經400目篩網過濾，去除未完全消化的組織塊及其他雜質成分。細胞濾液采用DMEM/F12培養液+10%FBS培養液進行原代細胞培養。每2～3 d進行換液，待細胞生長至90%，即可傳代。根據細胞生長狀態取第3代細胞進行后續實驗。

分離的第3代ESCs，光鏡下觀察呈紡錘形，然后采用免疫熒光染色法檢測Vimentin的陽性表達情況，確定細胞純度。

1.6含藥血清制備健康8周齡Wistar雄性大鼠10只，分為空白血清組3只，含藥血清組7只。根據人與大鼠等效劑量換算法[13]計算，含藥血清組按6 g/kg減味二藤湯水煎液灌胃，空白血清組給予灌胃等體積生理鹽水，早晚10∶00各1次，連續給藥7 d。第7天給藥后禁食不禁飲，最后一次給藥2 h后腹腔麻醉、取血、離心、濾膜除菌后保存于-80℃冰箱備用。

1.7 分組與給藥將細胞按照來源與給藥不同分為5組，即正常組、模型組、減味二藤湯含藥血清組（簡稱含藥血清組）和空白血清組、拮抗劑組。正常組，即正常組大鼠ESCs+10%FBS；模型組，即模型大鼠ESCs+10%FBS；含藥血清組，即模型大鼠ESCs+10%含藥血清；空白血清組，即模型大鼠ESCs+10%不含藥血清；拮抗劑組，即模型大鼠ESCs+10%含藥血清+10μmol·L-1PPAR-α拮抗劑GW6471。各組給藥48 h。

1.8 CCK-8法 觀 察ESCs活 性將ESCs按 照1×104/mL接種于96孔板中，各組細胞處理完成后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃孵育4 h后，用酶標儀測定。另設不加細胞僅含有培養液的空白孔調零。每組均設定3個復孔，實驗重復3次。

1.9 Western Blot法檢測ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋 白表達各組細胞處理完成后，裂解提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，將蛋白水浴煮沸5 min使其變性，自然冷卻后-20℃保存。實驗時，每個SDS-PAGE泳道分別加入50μg蛋白質，電泳時間約為2 h后將蛋白電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫低速搖床封閉2 h。0.1%TBST清洗封閉后的條帶膜，根據各目的蛋白質分子量切膜，各指標分別用相應的一抗（GAPDH以1∶1 000稀釋，PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ及Fibronectin以1∶1 500稀釋）孵育，4℃過夜。次日，TBST充分洗滌PVDF膜，分別加入相應的HRP標記的二抗（HRP標記山羊抗小鼠IgG，1∶5 000稀釋；HRP標記山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋），37℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌。利用電化學發光（ECL）試劑顯色，最后，使用ImageJ軟件（National Institutes of Health，美國）進行分析，目的蛋白的相對表達以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。實驗重復3次。

1.10 統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料呈正態分布且方差齊性，以均值±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠ESCs的鑒定圖1結果顯示，宮腔機械性損傷大鼠體外培養的ESCs和正常大鼠體外培養的ESCs波形蛋白（Vimentin）表達陽性，而模型大鼠ESCs表達量較正常大鼠ESCs增多，提示模型大鼠存在ESCs纖維化。

圖1 細胞免疫熒光法檢測ESCs中波形蛋白（Vimentin）表達結果（×200）Figure 1 Results of Vimentin expression in ESCs detected by cellular immunofluorescence（×200）

2.2 各組ESCs活力比較圖2結果顯示：與正常組比較，模型組的ESCs活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，空白血清組的ESCs活性無明顯差異（P＞0.05）；與空白血清組比較，含藥血清組ESCs活性降低（P＜0.01）；與含藥血清組比較，拮抗劑組ESCs活性升高（P＜0.05）。表明減味二藤湯對ESCs活性具有明顯的抑制作用，而PPAR-α拮抗劑GW6471處理可明顯拮抗減味二藤湯的抑制作用，使ESCs活性增強，這提示減味二藤湯可通過激活PPAR-α抑制ESCs活性。

圖2 各組子宮內膜基質細胞（ESCs）活力比較Figure 2 Comparison of the viability of ESCs among various groups

2.3 各組大鼠ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達比較

圖3、表1結果顯示：與正常組比較，模型組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達水平升高（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達水平降低（P＜0.05）；模型組各指標與空白血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白血清組比較，含藥血清組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達水平降低（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與含藥血清組比較，拮抗劑組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達水平升高（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達水平降低（P＜0.05）。表明PPAR-α拮抗劑GW6471能有效阻斷減味二藤湯對ESCs的抑制作用，進一步表明減味二藤湯可以有效降低子宮內膜機械性損傷大鼠ESCs的纖維化蛋白表達，其作用途徑可能是通過激活PPAR-α完成的。

圖3 各組子宮內膜基質細胞（ESCs）過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）、酰基輔酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fibronectin）蛋白電泳圖Figure 3 Protein electrophoresis of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），CollagenⅠ，Fibronectin in each group

表1 各組大鼠子宮內膜基質細胞（ESCs）過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）、酰基輔酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒堿棕櫚?；D移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fibronectin）相對蛋白表達量比較Table 1 Comparison of relative protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（CollagenⅠ）and fibronectin（Fibronectin）among various groups of ESCs in rats （±s）

表1 各組大鼠子宮內膜基質細胞（ESCs）過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）、酰基輔酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒堿棕櫚?；D移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fibronectin）相對蛋白表達量比較Table 1 Comparison of relative protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（CollagenⅠ）and fibronectin（Fibronectin）among various groups of ESCs in rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與空白血清組比較；④P＜0.05，與含藥血清組比較

組別正常組模型組空白血清組含藥血清組拮抗劑組α-SMA/GAPDH 0.196±0.009 0.812±0.083①0.772±0.060①0.481±0.033①②③0.686±0.040①③④CollagenⅠ/GAPDH 0.331±0.028 0.794±0.046①0.768±0.044①0.501±0.021①②③0.642±0.033①②③④Fibronectin/GAPDH 0.380±0.054 0.899±0.066①0.863±0.097①0.573±0.067①②③0.905±0.062①③④PPAR-α/GAPDH 0.922±0.053 0.490±0.037①0.485±0.023①0.720±0.048①②③0.535±0.029①③④ACOX1/GAPDH 0.896±0.065 0.398±0.055①0.324±0.018①0.854±0.029②③0.383±0.026①③④CPT1A/GAPDH 0.845±0.077 0.229±0.014①0.211±0.006①0.642±0.017①②③0.388±0.033①②③④

3 討論

目前宮腔機械性損傷引起的宮腔粘連發病機制尚不完全清楚，其本質為子宮內膜纖維化。研究發現，組織纖維化與胞內脂質的累積出現脂質毒性相關[5，14-16]。那么，如何有效促進ESCs的脂肪酸氧化，改善局部纖維化是目前值得深入研究的問題。

近年來研究發現，PPAR-α/FAO通路對維持脂質代謝的平衡起著十分重要的調節作用。激活PPAR-α可促進FAO進程，使細胞外基質進入細胞，由溶酶體進行降解，并減少脂肪酸（free fatty acid，FFA）和甘油三酯（triglyceride，TG）的合成，從而減輕細胞內脂質蓄積[17]。FAO限速步驟之一是FA進入線粒體，此過程由?；o酶A氧化酶（Acyl-Co A Oxidase，ACOX）依賴性的轉運系統控制，其中涉及的肉堿棕櫚?；D移酶I（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）是PPAR-α的直接靶基因[18]。

中醫學并無宮腔粘連的病名，可將其歸屬于“月經過少”“不孕”“痛經”等范疇，且認為其主要是由宮腔金刃損傷胞脈、脈絡瘀阻，致腎中精氣受損，沖任氣血不足，胞脈閉塞所致。葉天士云：“大凡絡虛，通補最宜。”故以活血通絡為主導，少佐補腎通經之品，通補兼施，可達治療IUA的目的[19]。減味二藤湯是由國家級名老中醫裘笑梅經驗方二藤湯篩選化裁而來，方中：君藥紅藤、忍冬藤可清熱通絡，臣藥威靈仙散結通絡，佐藥菟絲子可平調腎中陰陽，使藥牡丹皮涼血活絡，諸藥合用可清熱涼血、通經活絡，共奏調控腎-天癸-沖任-胞宮軸之效，從而達到補腎通絡調經的目的。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達水平升高，PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達水平下降，提示宮腔機械性損傷大鼠ESCs中PPAR-α/FAO通路受抑制，而與模型組/空白血清組比較，減味二藤湯含藥血清組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白 水平 降低，PPAR-α、ACOX1、CPT1升高，表明減味二藤湯可通過激活PPAR-α/FAO通路發揮改善ESCs纖維化的作用。

本研究發現，給予PPAR-α拮抗劑GW6471進行干預，與減味二藤湯含藥血清組比較，拮抗劑組ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達水平降低，α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin表達升高，細胞活性上升，表明GW6471可阻斷減味二藤湯對機械性損傷宮腔粘連大鼠ESCs纖維化的抑制作用，進一步表明減味二藤湯可通過激活PPAR-α/FAO通路實現對ESCs纖維化的改善作用。

綜上所述，減味二藤湯可激活PPAR-α/FAO通路，抑制ESCs纖維化進程，從而改善宮腔機械性損傷引起的宮腔粘連纖維化。