勻漿結合超聲-微波協同提取桔梗中桔梗皂苷D和黨參炔苷工藝研究

張慶芬，李占君，李曉雪，孫思全，李姣，楊逢建*

(1.森林植物生態學教育部重點實驗室(東北林業大學)，哈爾濱 150040; 2.黑龍江省林業科學院 伊春分院，黑龍江 伊春 153000)

0 引言

桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq)A.DC.)為桔梗科(Campanulaceae)桔梗屬(PlatycodonA.DC.)多年生開花植物，廣泛分布于我國東北、華北、華中和華南等各省區[1]。桔梗資源在我國有悠久的發展歷史，其根可入藥，亦可食用[2]。迄今已從桔梗根中分離出100多種化合物，主要包括皂苷類、多聚糖、黃酮類、酚類、聚炔類和甾醇類等化合物[3]。桔梗皂苷D是桔梗中的主要有效成分，《中華人民共和國藥典》將其作為桔梗藥材評價的質量標準，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌和免疫調節等藥理活性[4-6]，與此同時黨參炔苷是桔梗科植物在化學分類上的特征性成分，具有抗氧化、抗胃潰瘍及抗菌等藥理活性[7]。因此研究桔梗根中主要活性成分的提取、含量測定對桔梗資源的開發利用具有重要意義。

近幾年，從桔梗中提取分離主要活性物質方面的研究受到廣大研究學者的關注[8]。常用桔梗皂苷D的主要提取方法有傳統的回流法、索氏提取法(Soxhlet Extraction, SE)和超聲輔助提取法(Ultrasonic assisted extraction method, UAE)等[9]。而對桔梗中黨參炔苷提取工藝的相關報道較少。回流法、索氏提取法均存在提取時間長、提取后處理工作量大等缺陷，高溫情況下，桔梗皂苷D和黨參炔苷結構會受到破壞，因此，高效、低溫的萃取方法對桔梗中主要活性的提取十分重要。勻漿法具有節約溶劑、環保和高效等特點，主要通過液力和剪切力破壞細胞組織，從而使有效成分快速溶出，目前已在傳統藥物的天然活性成分提取方面得到了廣泛應用，常作為初級提取方法[10-11]。超聲-微波協同提取法將超聲波振動的空化效應和微波高能效應充分結合，能夠實現快速高效地提取植物中的有效成分[12]。

本研究首次將勻漿法與超聲-微波協同提取(Homogenate Pretreatment and Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction, HPUME)結合起來運用于桔梗中桔梗皂苷D和黨參炔苷的提取，并利用單因素實驗和Box-Behnken響應面實驗確定該方法的最佳提取工藝，并與索氏提取、超聲輔助提取工藝進行比較，證實該方法高效環保、方便快捷，為桔梗的深度開發及其他天然活性成分的提取提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

實驗所用的桔梗藥材購買于安徽亳州藥材市場。50 ℃恒溫鼓風干燥，粉碎過24目備用。桔梗皂苷D標準品(HPLC級，純度大于等于98%，上海源葉生物科技有限公司)、黨參炔苷標準品(HPLC級，純度大于等于98%，上海源葉生物科技有限公司)、超純水實驗室自制、色譜級乙腈和色譜級甲醇(SK HOLDINGS公司)、分析級乙醇(天津市致遠化學試劑有限公司)。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(型號：1260，美國安捷倫公司)；可調高速勻漿機(型號：FSH-2A，武漢格萊莫檢測設備有限公司)；超聲-微波協同萃取儀(型號：CW-2000，上海新拓分析儀器科技有限公司)；數控超聲清洗機(型號：JP-100ST，深圳市潔盟清洗設備有限公司)；電子分析天平(型號：UH620H，日本SHIMADZU島津)；微型中藥粉碎機(型號：HC-250T，浙江河城工貿有限公司)。

2 實驗方法

2.1 樣品溶液的制備

精確稱量5.00 g桔梗粗粉，按料液比1∶30(g/mL)加入體積分數為60%乙醇溶液，室溫下勻漿(10 000 r/min)提取5 min后，立即轉移到超聲-微波提取儀容器中，調整溫度為50 ℃，微波功率為700 W(超聲額定功率為50 W)的條件下，提取10 min后，8 000 r/min離心15 min，吸取1 mL上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，得樣品溶液。

2.2 桔梗皂苷D和黨參炔苷的測定

2.2.1 測定波長的選擇

對2種目標化合物的甲醇溶液進行全波長掃描，在210 nm 處測定可兼顧桔梗皂苷D和黨參炔苷2個成分的最大吸收，且色譜圖基線較平穩，色譜峰峰形較好，故選擇210 nm作為本實驗的檢測波長。

2.2.2 液相色譜條件

使用Diamonsil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，桔梗皂苷D和黨參炔苷檢測條件：流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸水溶液，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；梯度洗脫，洗脫梯度條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 標準曲線的繪制

精密稱取各對照品適量，用甲醇配制桔梗皂苷D1 mg/mL和黨參炔苷0.125 mg/mL的標準品貯備溶液，將桔梗皂苷D稀釋為0.032 5、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0 mg/mL的標準品溶液，黨參炔苷稀釋為0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.032 5、0.062 5 mg/mL的標準品溶液。分別進樣20 μL測定峰面積值。以質量濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，分析得到

桔梗皂苷D的回歸方程為y=2 927x-92.525(R2=0.999 4)，線性范圍為0.032 5～0.500 0 mg/mL；黨參炔苷的回歸方程為y=64 778x+42.322(R2= 0.999 3)，線性范圍為0.003 9～0.062 5 mg/mL。標準品和樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標準品溶液和樣品溶液色譜圖

2.2.4 含量的測定

由樣品溶液測得峰面積值得到樣品質量濃度，計算出桔梗中桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量，計算公式為

(1)

式中:Y為活性成分的含量，mg/g；C為單位體積提取液中活性成分的質量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；M為桔梗粗粉的質量，g。

2.3 單因素實驗設計

2.3.1 料液比的影響

稱取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇為提取溶劑，勻漿處理5 min，轉移到超聲-微波提取儀容器中，微波功率700 W，溫度30 ℃，提取時間10 min，分別考察料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g/mL)對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量的影響。

2.3.2 勻漿處理時間的影響

稱取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20(g/mL)，轉移到超聲-微波提取儀容器中，微波功率700 W，溫度30 ℃，提取時間10 min，分別考察勻漿時間為1、2、3、4、5、6 min時對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量的影響。

2.3.3 溫度的影響

稱取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20(g/mL)，勻漿處理5 min，轉移到超聲-微波提取儀容器中，微波功率700 W，提取時間10 min，分別考察溫度為30、40、50、60、70、80 ℃對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量的影響。

2.3.4 超聲微波時間的影響

稱取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20(g/mL)，勻漿處理3 min，轉移到超聲-微波提取儀容器中，微波功率為700 W，溫度50 ℃，分別考察超聲微波時間為0、5、10、15、20、25、30 min對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量的影響。

2.3.5 微波功率的影響

稱取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20(g/mL)，勻漿處理3 min，轉移到超聲-微波提取儀容器中，溫度50 ℃，提取時間15 min，分別考察微波功率為300、400、500、600、700、800 W時對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量的影響。

2.3.6 乙醇體積分數的影響

稱取桔梗粗粉5.00 g，料液比1∶20(g/mL)，勻漿處理3 min，轉移到超聲-微波提取儀容器中，溫度50 ℃，提取時間15 min，微波功率為600 W，分別考察乙醇體積分數為30%、40%、50%、60%、70%、80%時對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量的影響。

2.4 響應面法優化提取工藝

以單因素實驗結果為基礎，選取對桔梗皂苷D和黨參炔苷含量影響較高的3個因素：超聲微波時間(A)、微波功率(B)和乙醇體積分數(C)作為自變量，采用三因素三水平設計Box-Beheken Design實驗，實驗因素與水平見表2。

表2 響應面實驗因素水平表

2.5 提取方法的比較

2.5.1 索氏提取法

將10.00 g桔梗粉末放入濾紙包中，置于索氏提取器中，按料液比為1∶20(g/mL)加入75%的乙醇溶液，在75 ℃恒溫下提取6 h，離心，取2 mL上清液過0.22 μm有機濾膜，即為索氏提取法下供試品溶液[13]。

2.5.2 超聲輔助提取法

取2.00 g桔梗粉末，加入50%乙醇溶液50 mL，在超聲功率為250 W的條件下超聲處理30 min，冷卻后稱重，補足重量，離心，取2 mL上清液過0.22 μm有機濾膜，即為超聲輔助提取法下供試品溶液[14]。

2.6 數據統計與處理

所有實驗平行重復3次，各項數據均以算術平均值±標準差形式表示。實驗數據的統計與處理使用軟件Origin 2018和Design Expert 8.0.6 Trial。

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 不同料液比對目標產物含量的影響

實驗得到不同料液比對目標產物含量的影響情況，如圖2所示。

由圖2(a)可知，當料液比為1∶10～1∶35(g/mL)時，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量呈先升高后緩慢降低的趨勢，并且在料液比等于1∶20(g/mL)時，含量最高。這是因為在一定的范圍內，隨著料液比的增加，使得桔梗與提取溶劑的接觸率大大增加，導致桔梗皂苷D和黨參炔苷的溶解量逐漸增加；而當料液比超出一定范圍后，會阻礙微波與超聲對溶質的輻射和空化作用，還伴隨著雜質的溶出，這不但會降低目標產物的提取率，而且產生后續濃縮工業的成本[15]，故選擇料液比為1∶20(g/mL)進行下一步優化。

3.1.2 不同勻漿處理時間對目標產物含量的影響

由圖2(b)可知，當勻漿時間為0～3 min時，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量呈上升趨勢，當勻漿時間大于3 min時，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量基本趨于穩定。這是因為桔梗粗粉在勻漿機的剪切作用下進一步破碎，隨著勻漿時間的增長，細胞破碎度增大，提高了細胞內目標成分向溶劑乙醇溶液擴散的效率。但過長的勻漿時間，糖類和蛋白等雜質不斷溶出，阻礙目標產物的溶出，使得目標產物含量不再明顯增加[16]。故選擇3 min作為最佳勻漿時間。

3.1.3 不同溫度對目標產物含量的影響

由圖2(c)可知，隨著提取溫度的增加，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量也在逐漸上升，在50 ℃ 時含量最高，隨后又呈下降的趨勢。其原因是在一定范圍內適當提升溫度有利于促進溶劑在粉末與溶液體系之間的穿梭與滲透[17]，但桔梗皂苷D在高溫下結構發生改變，黨參炔苷結構中含有炔鍵，易發生加成、氧化等反應，在提取過程中，易受高溫等因素的影響而發生結構變化，從而導致含量降低[18-20]。綜上分析可得，選擇50 ℃為最佳提取溫度進行下一步優化。

3.1.4 不同超聲微波時間對目標產物含量的影響

由圖2(d)可知，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量隨著時間的增加而增加，提取時間達到15 min時的含量最大，15 min以后隨著時間的延長提取率反而下降。這是由于隨著提取時間延長，超聲-微波協同提取的各種效應增強，有利于成分的溶出，但萃取體系溫度升高和受熱時間延長，桔梗皂苷D和黨參炔苷結構可能發生變化，雜質溶出增多，導致含量下降[20-21]。因此選擇10～20 min的提取時間進行后續優化實驗。

3.1.5 不同微波功率對目標產物含量的影響

由圖2(e)可知，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量隨著微波功率的增大而增大，當微波功率達到600 W時，含量達到最大，隨著微波功率的增加桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量略有下降。這是因為超聲和微波協同作用促進植物細胞壁的破裂和分子的布朗運動，進而促進了目標化合物的溶出，但微波功率過高導致萃取體系溫度過高，桔梗皂苷D和黨參炔苷結構受到破壞，導致含量降低[20-22]。因此選擇500～700 W的微波功率進行后續優化實驗。

圖2 單因素實驗結果

3.1.6 不同乙醇體積分數對目標產物含量的影響

由圖2(f)可知，當乙醇體積分數小于60%時，桔梗皂苷D和黨參炔苷含量隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數高于60%時，桔梗皂苷D和黨參炔苷含量隨乙醇體積分數的增加而逐漸降低。這說明體積分數較高的乙醇溶液不利于目標化合物的溶出。因為桔梗皂苷D為水溶性物質，體積分數為50%～70%的乙醇與目標化合物的極性相似，有利于目標化合物的溶出。隨著乙醇體積分數升高，溶劑的極性下降，對目標成分的溶解作用下降，導致含量下降。所以選擇體積分數為50%～70%的乙醇進行后續優化實驗。

3.2 響應面優化實驗結果

3.2.1 響應模型的建立與顯著性檢驗

響應面試驗設計方案與試驗結果見表3。利用Design Expert8.0.6 Trial軟件對表3數據進行多元回歸擬合，得到含量(Y)對超聲微波時間(A)、微波功率(B)和乙醇體積分數(C)的二次多項回歸方程模型如下。

表3 中心組合優化方案及結果

桔梗皂苷D：

Y1= 5.26 + 0.029A-0.090B-0.078C+ 0.063AB-0.052AC-0.014BC-0.26A2-0.29B2-0.19C2。

(2)

黨參炔苷：

Y2= 0.25 + 4.875 × 10-3A-0.011B-6.625 × 10-3C+ 8.50 × 10-3AB-2.25 × 10-3AC-2.50 × 10-3BC-0.017A2-0.020B2-0.012C2。

(3)

由表4分析可知，F表示模型擬合方程的顯著程度，即F越大，表示擬合程度越好。桔梗皂苷D和黨參炔苷模型的F分別為55.49、19.55，P均小于0.01，表明模型擬合方程顯著，模型差異極顯著，具有統計學意義；失擬項分別為0.224 6、0.424 4，均大于0.05，說明差異不顯著，模型擬合度良好，可對實驗結果進行分析。在各影響因素中，一次項A(時間)對桔梗皂苷D含量的影響不顯著，對黨參炔苷含量影響顯著，B(微波功率)和C(乙醇體積分數)的P均小于0.01，說明對2種目標活性成分的含量均具有極顯著影響，且由F值大小可知，B>C，說明B對桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量影響最大。在組合因素中AB的P小于0.05，說明對2種目標成分的含量均有顯著影響，BC、AC的P均大于0.05，說明這2個組合因素對2種目標成分含量具有不顯著影響。二次項A2、B2、C2的P均小于0.01，說明對2種成分含量均具有極顯著影響。

表4 響應面擬合回歸方程方差分析結果

由表5可知，兩模型的決定系數R2分別為0.986、0.962，調整決定系數R2分別為0.968、0.913，均大于0.9，變異系數均小于5%。結果表明，模型擬合度良好，可用于后續對實驗結果的分析與預測。

表5 置信分析表

由圖3(a)和圖3(b)桔梗皂苷D和黨參炔苷模型的殘差正態分布圖可以看出，目標產物的模型中的大多數點都靠近同一直線，分布合理，符合正態分布；目標產物含量的預測值與實際值的對應關系如圖3(c)和圖3(d)所示，大多數點都靠近同一直線，表明實際值和預測值之間有較好的一致性，可用于模型分析預測目標產物隨考察條件的變化。

圖3 殘差的正態分布、預測值與實際值關系圖

3.2.2 響應面優化傘狀圖

圖4為關鍵因素響應面設計和優化所對應的傘狀圖，從圖像中可以更直觀地反映出被優化因素對響應值Y(目標產物含量)的影響強度[23]。通過分析3D傘狀圖可以確定優化因素的極值和中間值。由傘狀圖的陡峭程度和下方2D等高線的形狀(圓形或橢圓形)可以看出各個因素之間的交互作用是否顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形與之相反[24]。結合數據和模型，響應值(Z軸)和2個影響因素(X軸和Y軸)建立RSM擬合模型，分析3D傘狀圖時將其中一單因素設置定量為0。

對圖4(a)和 圖4(b)分析可知，在一定范圍內，隨著A和B的提升，桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量逐漸提高，直至含量達到最高值后開始降低。由圖像中可以直觀地看出，圖4(a)圖和圖4(b)圖的響應曲面坡度較陡，等高線圖均為橢圓形，說明A、B之間交互作用表現為差異性顯著。當A為15 min，B為581 W，此時桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量最高。

同理，對圖4(c)—圖(f)分析可知，傘狀圖的曲面坡度均較平緩，等高線圖均為圓形，目標產物含量最高時的條件分別為：BC(581 W, 58%)，AC(15 min, 58%)，且B、C和A、C之間交互作用均表現為差異性不顯著。根據傘狀圖的坡度，可以得出組合影響因素AB、BC、AC中各因素的影響程度，B>A，B>C，C>A，因此B>C>A，與表4分析結果一致。

圖4 優化因素的傘狀圖

3.2.3 驗證試驗

基于上述模型，優化得到的桔梗皂苷D和黨參炔苷的最佳工藝條件為：勻漿預處理3 min，乙醇體積分數57.53%，料液比1∶20(g/mL)，微波功率580.55 W，提取時間15.40 min，溫度50 ℃，最優預測含量分別為5.276、0.249 mg/g。為驗證實驗結果的可靠性，在最佳工藝條件下進行重復性實驗，結果顯示桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量分別為5.24 mg/g±0.13 mg/g和0.24 mg/g±0.01 mg/g，與預測值吻合度較高，說明該優化條件可靠。

3.3 與其他提取工藝比較

通過表6可知，勻漿結合超聲-微波協同提取法提取桔梗皂苷D和黨參炔苷的含量高于索氏提取和超聲提取，具有節省提取時間、高效和不破壞活性物質結構的優點。另外超聲容易在提取物周圍形成超聲空白區，還會造成較大的噪音[25]。

表6 不同提取工藝中主要參數及含量比較

4 結論

本文對勻漿結合超聲-微波協同提取法同時提取桔梗皂苷D和黨參炔苷的工藝進行了全面的研究。在單因素實驗基礎上，利用BBD響應面實驗進行了優化分析，結果表明最佳提取工藝參數為：勻漿預處理3 min，乙醇體積分數58%，料液比1∶20(g/mL)，微波功率580 W，提取時間15 min，溫度50 ℃，此條件下桔梗皂苷D的含量為5.24 mg/g±0.13 mg/g，黨參炔苷的含量為0.24 mg/g±0.01 mg/g，高于傳統的索氏提取法與超聲輔助提取法的含量，并且具有提取時間較短、節省溶劑以及噪音小等優點。

此方法高于孫印石等[26]用微波輔助提取法得到的3.87 mg/g桔梗皂苷D得率。綜上所述，勻漿結合超聲-微波協同提取法在桔梗的主要活性成分的提取中更具有優勢，為桔梗的深度開發利用提供科學依據。本實驗只對桔梗皂苷D和黨參炔苷的提取進行了研究，2種成分的分離純化與藥理活性還有待進一步研究。