沙棗種子總黃酮提取工藝優化及體外抗氧化性分析

凱迪日耶·玉蘇普，蔣海明

（1.喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844006；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態重點實驗室，新疆 喀什 844006）

尖果沙棗（Elaeagnus oxycarpa Schlechtend）屬胡頹子科胡頹子屬，沙棗樹適應性強，能在高鹽高堿等極端環境中生長發育[1-2]。沙棗及其果實可用于食品、醫藥、香料和木材等領域[3]。尖果沙棗果實營養成分高，其含有大量的生物揮發油、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物、維生素和其他生物活性化學物質[4]。黃酮類化合物是一類普遍存在于光合作用細胞中的天然化合物。截至目前，已分離鑒定出1萬多種黃酮類化合物[5]。黃酮類化合物（通常指維P）是僅存在于植物中的具有苯并-γ-吡喃酮結構，可以分為不同類型，黃酮醇類、黃烷醇類、異黃酮類和黃烷-3-醇類[6]。黃酮類化合物有廣泛的生物學功能，如抗氧化、降血脂、緩解疲勞、預防動脈粥樣硬化等，研究發現黃酮類化合物比維C和維E具有更強的抗氧化潛力，因此對黃酮類化合物的研究越來越受到重視[7-8]。

有關沙棗種子中總黃酮提取工藝及體外抗氧化性相關的研究均未見國內外文獻報道。新疆沙棗的分布面積廣泛、生產量高、價格低。研究應用超聲波提取沙棗種子的總黃酮，通過正交試驗優化最佳提取條件，并采用DPPH自由基清除能力指數評價總黃酮的體外抗氧化活性，為充分利用沙棗資源、進一步開發黃酮類化合物提供了有益參考。

1 材料

1.1 材料

沙棗，采自新疆喀什地區岳普湖縣沙棗林。沙棗果實取種子，自來水洗干凈，烘干，并用粉碎機將沙棗種子粉碎，過40目篩，取篩出粉末，放4℃冰箱中備用。

1.2 試劑

甲醇（CH3OH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁（Al(NO3)3）、氫氧化鈉（NaOH）、蘆丁標準品、乙醇（CH3CH2OH）和1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（DPPH試劑），以上試劑均為分析純，國藥化學試劑有限公司提供。

1.3 儀器與設備

MS-01h型磁力攪拌器，廣州立珠生物科技有限公司產品；E204e/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品中；T6型新世紀紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；SHB-III型循環水式真空泵，武漢華科達實驗設備有限公司產品；CQ-300B型超聲波清洗機，上海量壹科學儀器有限公司產品；ZF-06a型脂肪測定儀，上海瑞正儀器設備有限公司產品；UP-II-20t型優普超純水器，四川優普超純科技有限公司產品；Re-52aa型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的制備

參考林文珍等人[9]、蔣麗施等人[10]方法并略做修改。準確稱取蘆丁標準品10 mg，于105℃下干燥至恒質量，加入甲醇溶液45 mL。待蘆丁標準品完全溶解后，甲醇溶液定容至50 mL，得到質量濃度0.19 mg/mL的蘆丁標準溶液。用可調節微量移液器將0，1，2，3，4，5 mL蘆丁標準溶液加入到6支干燥的棕色容量瓶中，取質量分數為4%的NaNO2水溶液1 mL，依次加入到以上6支容量瓶中，混勻靜置6 min，再取質量分數為10%的Al(NO3)3水溶液1 mL依次加入到棕色容量瓶中，搖勻后靜置6 min，最后加入質量分數為4%的NaOH溶液10 mL，加水至25 mL刻度線進行定容。搖勻后，靜置15 min進行顯色。將相應的溶劑作為空白對照試驗，于波長510 nm處測量吸光度A，重復3次，并進行線性相關性考查。

以蘆丁標準質量濃度（mg/mL）為橫坐標，于波長510 nm處的吸光度A為縱坐標，制作標準曲線。線性回歸方程為Y=11.267X+0.002 4，R2=0.998。結果表明，線性回歸方程具有良好的相關性，以0.007 6～0.038 0 mg/mL質量濃度范圍以內，線性關系良好。

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 供試品溶液的制備

用電子天平稱取1 g沙棗種子粉末，用濾紙包好，用體積分數為70%的乙醇溶液浸泡2 h。然后于60℃條件用下回流提取1 h，提取液定容至50 mL，得供試品溶液，放4℃冰箱備用。按照2.1中的方法，測定吸光度A，根據標準曲線的回歸方程得出提取液中黃酮的質量濃度，根據黃酮質量濃度計算公式計算黃酮含量。黃酮含量計算公式如下：

式中：C——代入線性回歸方程測定總黃酮的質量濃度，mg/mL；

D——稀釋倍數；

V——供試液的體積，mL；

m——種子粉末的質量，g；

2.3 方法學考查

2.3.1 穩定性試驗

精密量取蘆丁標準品溶液3 mL及供試品提取溶液3 mL。參照2.1中的方法，分別在5，10，20，40，50，60 min，于波長510 nm處測定對照品和供試品提取溶液的吸光度A，觀察亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法對黃酮顯色效果的穩定性。結果表明，對照品吸光值RSD=2.003%（n=6），供試品吸光度RSD=4.106%（n=6），說明對照品、供試品提取溶液1 h以內具有較好的穩定性。

穩定性試驗結果見表1。

表1 穩定性試驗結果

2.3.2 精密度試驗

精密量取5份同一來源的對蘆丁標準溶液和5份同一來源的供試品提取溶液，每份用可調節微量移液器吸取3 mL溶液。參照2.1中的方法，測定其吸光值并計算RSD值，以便考查試驗方法的精密度。結果表明，對照品溶液吸光度RSD=1.203%（n=5），供試品提取溶液吸光度RSD=4.706%（n=5）。結果表明該方法精密度良好。

精密度試驗結果見表2。

表2 精密度試驗結果

2.3.3 重復性試驗

精密稱取5份沙棗種子粉末，每份為1.0 g，根據2.2供試品提取溶液的制備方法，制備5份供試品提取溶液。參照2.1中的方法，測定其吸光度，計算RSD值，考查試驗的重復性。結果表明，供試品吸光值RSD=3.24%（n=5），說明該試驗方法重復性較好。

重復性試驗結果見表3。

表3 重復性試驗結果

2.3.4 加樣回收率試驗

精密稱取3份沙棗種子粉末，每份為1.0 g，按照2.2供試品溶液的制備方法和工藝來制作供試品提取溶液。得到供試品溶液后，各取3 mL在25 mL棕色容量瓶中備用，依次加入0.19，0.38，0.54 mg的蘆丁標準品溶液，參考2.1的方法，于波長510 nm處測定溶液的吸光度，測定總黃酮含量，計算回收率RSD，考查加樣回收率。結果表明，3次回收率測定的平均值為104.61%，RSD=4.65%（n=3），說明用該方法測定黃酮含量的準確度高，方法可靠。

回收率試驗結果見表4。

表4 回收率試驗結果

2.4 超聲提取與回流取方法比較

2.4.1 乙醇超聲提取法

稱取1 g沙棗種子粉末，將沙棗種子粉末在體積分數為95%乙醇溶液50 mL中浸泡2 h，設置超聲功率300 W，提取時間0.5h。用水浴循環真空泵過濾，濾渣中再加入體積分數為95%的乙醇溶液50 mL，設置超聲功率300 W，提取時間0.5 h。用水浴循環真空泵過濾，合并2次濾液得到提取液定容至100 mL棕色容量瓶中。將上述提取液稀釋5倍，精密量取3 mL溶液放置在25 mL棕色容量瓶中。參照2.1中的方法，測定其吸光度，并按照公式計算總黃酮含量。

2.4.2 乙醇回流提取法

稱取1 g沙棗種子粉末，將沙棗種子粉末在體積分數為95%乙醇溶液50 mL中浸泡2 h，索氏提取法60℃下回流提取1 h，提取2次。合并2次的乙醇提液，定容至100 mL。將上述提取液稀釋5倍，精密量取3 mL溶液放置在25 mL容量瓶中備用。參照2.1中的方法，測定其吸光度，并按照公式計算總黃酮含量。由表6可知，與回流提取法相比，超聲提取法提取的黃酮得率要比回流提取法提取出的黃酮得率高。

不同提取方法提取效果比較見表5。

表5 不同提取方法提取效果比較

2.5 正交試驗設計

精確稱9分沙棗種子粉末，每份為1.0 g。按照L9（34）正交試驗設計表（見表6）中確定的加入乙醇用量、加入乙醇的體積分數、提取時間和提取次數共4個因素條件，超聲波提取法提取總黃酮。參照2.1中的方法，測定其吸光值，按照公式計算總黃酮含量。通過正交設計軟件對數據進行分析，4個因素對于總黃酮提取的影響大小分別為提取次數（D）＞料液比（A）＞提取時間（C）＞乙醇體積分數（B）。對K1、K2、K3值的比較，各因子水平的基本影響為A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C3＞C1＞C2，D2＞D3＞D1。經 過 四因素三水平的綜合考查，沙棗種子中總黃酮的提取最優條件是A3B2C1D3，即乙醇加量30倍，乙醇體積分數70%，提取時間0.5 h，提取次數3次，所得的黃酮含量最高為5.077 mg/g。

正交試驗因素與水平設計見表6，正交試驗表及結果見表7。

表6 正交試驗因素與水平設計

表7 正交試驗表及結果

2.6 最佳提取工藝驗證試驗

根據試驗結果優選出來的最優工藝參數A3B2C1D3，按照30倍乙醇用量，乙醇體積分數為70%，提取時間0.5 h和提取次數3次進行驗證試驗。

正交試驗驗證見表8。

表8 正交試驗驗證

試驗結果表明，通過驗證試驗得到的平均總黃酮含量平均為5.102 mg/g，RSD＜1%。通過驗證試驗所得的黃酮含量與最佳工藝所得結果基本一致，說明該方法穩定可靠，驗證了提取工藝的可行性。

2.7 對DPPH自由基清除能力的測定

準備5支25 mL棕色容量瓶，依次向容量瓶加入已知濃度的供試品溶液。然后向每個容量瓶中加入0.01 mg/mL DPPH溶液4 mL，加水定容至刻度，搖勻。于波長517 nm處測定吸光試，記作A0；室溫避光靜置30 min，記錄波長517 nm處吸光度，記作Aj；對照組試驗為只加DPPH的水溶液，吸光度記作Ap按照以下公式計算出自由基清除率W。

沙棗種子黃酮提取液對DPPH自由基清除效果見圖2。

由圖2可知，沙棗種子的乙醇提取物對于DPPH自由基具有一定的清除作用，并且隨著濃度的增加，對于氧自由基的清除率也在增強，但是清除率較低。

圖2 沙棗種子黃酮提取液對DPPH自由基清除效果

3 結論

沙棗果、花、葉、枝均含有多種有益的營養成分，具有較高的應用開發潛力和經濟價值[11]。沙棗中含有黃酮、多糖、芳香油等重要的生物活性成分，沙棗葉、花、果實、種子中富含黃酮類化合物，黃酮類化合物的物學功能廣泛，具備多種藥理學作用，研究發現沙棗中黃酮類化合物的含量約為0.68%～1.16%[12-13]。由此可見，沙棗是一種環境效益與經濟效益相結合的鹽生植物，是一種具有開發市場前景的重要資源。作為重要的植物資源，沙棗的重要性被大家忽視，資源開發不夠充分?，F階段，只有一小部分大棗用于民間藥用，采摘或基本生產加工，食用或初步加工，利用率極低，更談不上綜合開發利用，導致如此寶貴的資源被大量浪費。

黃酮類化合物是植物獨特的次生代謝產物。對于植物本身而言，黃酮類化合物在植物生理和生態等方面中發揮著多種作用，包括保護植物免受紫外線和病原菌的傷害、吸引昆蟲授粉、調節植物的雄性生育力、調控細胞周期，并參與植物激素的運輸等[14]。從其經濟開發和應用來看，黃酮類化合物有重要的藥用價值，對許多人類疾病具有治療效果。黃酮類化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多種功能。因此，對黃酮類等化合物的研究和應用逐漸成為熱點[15]。

研究采用超聲法提取技術對尖果沙棗中總黃酮的提取條件及體外抗氧化活性進行初步研究，確定最佳提取工藝參數為乙醇用量30倍，乙醇體積分數70%，提取時間0.5 h，提取次數3次，在以上工藝優選條件下重復試驗3次，平均提取含量5.102 mg/g。研究結果表明，沙棗種子黃酮類化合物具有DPPH自由基清除作用，并具有一定的體外抗氧化活性。研究旨在提高尖果沙棗資源的合理利用率，為進一步開發尖果沙棗黃酮類在天然藥物領域應用、開發研究等方面提供了有益參考依據。