竹蓀酸漿發酵工藝優化及其作為豆腐凝固劑的應用

張巧玲，陳 浩，2，李冰鑫，林碧蓮，2，周曉潔，2，趙良忠，2

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000）

酸漿豆腐因其豆香濃郁、質地細膩、適合各種烹飪手段等優點，深受大眾追捧和喜愛。有別于石膏豆腐或鹽鹵豆腐，酸漿豆腐是以其生產副產物——黃漿水經自然發酵或純種發酵制得的酸漿作為凝固劑，不僅賦予了產品特有的氣味和滋味，而且減少了副產物的排放[1]。近年來，隨著消費者越來越注重食品的營養和風味，如何賦予這一傳統食品更多的保健功能、更誘人的風味，成為酸漿豆腐產品創新的目標之一。研究人員嘗試將山楂、西紅柿、沙棘、酸棗等含天然酸性成分的功能食品替換傳統酸漿凝固劑，制備出具有保健價值的豆腐[2-3]。但是，這些豆腐新產品相比于傳統酸漿豆腐，質地較為松散、彈性欠佳、口感不夠細膩，甚至有少量的澀味，不利于后續的烹飪或加工。迄今未見有將功能食品和黃漿水混合發酵制備凝固劑的相關研究。

竹蓀（Dictyophora）是一種珍貴的可食用腐生真菌，被稱為“菌中王后”。竹蓀富含8種人體必需氨基酸，以及維E、煙酸、甘露聚糖和木聚糖等生物活性物質[4]。已有研究表明，竹蓀具有免疫調節、抗腫瘤、抗酪氨酸酶、抗炎和抗氧化等保健作用[5-7]。竹蓀子實體通常分為菌蓋、菌柄、菌裙和菌托等部位，其中菌托占鮮重的一半以上，在采摘和加工中卻被大量丟棄。然而，梁亞麗等人[8]研究表明，菌托與其他部分一樣，營養成分較全面，是一種尚未得到有效利用的資源。目前，通過益生菌發酵制備具有功能特性的酵素是利用果蔬副產物的常用方法之一。楊培青等人[9]以藍莓加工下腳料為原料，優化發酵工藝，得到了香氣清爽、酸味純正的藍酶果渣酵素。包怡紅等人[10]則以藍靛果與米糠進行復合發酵獲得了以草酸、抗壞血酸和檸檬酸為主的酵素。邵洋洋等人[11]以廢棄菇柄為原料，以植物乳桿菌進行液體發酵獲得具有抗氧化活力的呈酸性酵素。由此可見，酵素不僅具有多種功能性成分，還含有有機酸，有替代傳統酸漿作為豆腐凝固劑的潛力。

以竹蓀菌托和黃漿水為原料，選用植物乳桿菌和酵母菌進行發酵，通過發酵工藝的優化，研制出一種能替代傳統酸漿的新型豆腐凝固劑，并以其為凝固劑生產了竹蓀酸漿豆腐。不僅可以解決竹蓀菌托和黃漿水的廢物利用問題，還拓寬了酵素應用范圍，提升了豆腐的營養價值，符合當代消費者對綠色、營養食品的追求，為豆腐新產品開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，邵陽市糧庫提供；竹蓀，貴陽恒昌生態農業有限公司提供；植物乳桿菌，無錫拜弗德生物科技有限公司提供；酵母菌，湖北安琪酵母股份有限公司提供；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，北京奧博星生物科技有限責任公司提供；纖維素酶，寧夏夏盛實業集團有限公司提供；木瓜蛋白酶、果膠酶，上海源葉生物科技有限公司提供；酸漿豆腐、黃漿水，豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室提供。

1.2 儀器與設備

J-1型熟漿豆腐生產設備，北京康得利智能科技有限公司產品；GI54DWS型立式滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司產品；HPX-9272 MBE型恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；SW-CJ-ID型單人超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備廠產品；EM502C型電子溫度計，漳州市東方智能儀表有限公司產品；SY-1210型恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠產品；卡路里分析儀，北京盈盛恒泰科技有限責任公司產品；EL20型pH計、MJ33型水分自動測定儀，梅特勒-托利多公司產品；VELOCITY 18R型高速冷凍離心機，澳大利亞Dynamica公司產品；CR-400型色差計，常州三豐儀器科技有限公司產品；LS型質構儀，阿美特克有限公司產品；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

①菌種→活化→接種；

②竹蓀→前處理→酶解→滅菌；

③新鮮黃漿水→滅菌；

①+②+③→發酵→竹蓀酸漿→制作豆腐。

1.3.2 操作要點

（1）竹蓀的前處理。用新鮮竹蓀菌托等副產物置于清水中洗凈、晾干，放入粉碎機中粉碎至60目，即得到竹蓀粉末。

（2）竹蓀的酶解。參考鞏貴麗[12]的方法，進行微調：分別將果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶按比例1.5%，2.0%，2.0%（W/V）加至30 mL蒸餾水中，接著加入1 g竹蓀粉，于50℃水浴中磁力攪拌2 h，于85℃下滅酶15 min，即得到竹蓀酶解液。

（3）菌種的活化。參考陳斌等人[13]的方法，稍作調整：將適量植物乳桿菌菌粉懸浮于10 mL無菌MRS液體培養基，并于37℃下培養12 h，經2次傳代后，作為種子液備用。

參考楊培青等人[9]的方法，稍作調整：將酵母菌菌粉溶于10 mL無菌YPD液體培養基懸浮，于30℃下中培養24 h，經2次傳代后，作為種子液備用。

（4）竹蓀酶解液和黃漿水的滅菌。分別將竹蓀酶解液和過濾除雜的新鮮黃漿水于121℃下滅菌15 min。

（5）接種和發酵。將已滅菌的竹蓀酶解液和黃漿水按1∶4（V∶V）混合，采用碳酸鈣調節發酵初始pH值至6.0。將植物乳桿菌和酵母菌種子液培養至對數期，按比例為1∶1進行接種，接種量為4%，于37℃下發酵48 h，過濾除雜，即得到竹蓀酸漿。

1.3.3 單因素試驗

以菌種接種量（2%，4%，6%，8%，10%）、發酵初始pH值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）、發酵溫度（29，33，37，41，45℃）、發酵時間（24，36，48，60，72 h）為因素，考查上述因素對竹蓀酸漿總酸含量的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取菌種接種量（A），發酵初始pH值（B），發酵溫度（C），發酵時間（D）等4個因素設計L9（34）正交試驗，以總酸含量為評價指標，優化竹蓀酸漿發酵工藝。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.3.5 總酸的測定

參照呂博等人[14]的方法測定總酸。

1.3.6 OD值的測定

菌體數量以樣品于波長600 nm處的吸收值（OD值）表示。

1.3.7 總酚的測定

參照Wang L等人[15]的Folin Ciocaulten方法測定。

1.3.8 豆腐的制備

按照思旭平等人[2]方法制作豆腐，點漿改用試驗的竹蓀酸漿為豆腐凝固劑。

1.3.9 豆腐品質的評價

（1）水分含量的測定。豆腐的水分含量使用快速水分測定儀進行測定。

（2）營養成分的測定。取100 g豆腐搗碎，使用卡路里分析儀測定蛋白質、碳水化合物、脂肪等主要營養成分。

（3）質構的測定。選用TPA模式分別測定樣品的硬度、彈性、咀嚼性等指標。設置參數為探頭型號P35，測試前速度40 mm/s，測試中速度40 mm/s，測試后速度40 mm/s，下壓距離40%，觸發力0.05 N。要求樣品大小一致，一個樣品取5個不同部位。

（4）色澤的測定。將色差計用白板校準后，鏡頭對準豆腐表面測定色差值L*值、a*值和b*值。

（5）感官評價。感官評定小組由10名且經過感官評價訓練的食品專業學生組成，分別對風味（30分）、色澤（20分）、口感（30分）及組織形態（20分）進行感官評分。

感官評價標準見表2。

表2 感官評價標準

1.3.10 數據處理

每組試驗重復3次，結果以平均值±標準差表示，數據采用SPSS 18.0進行顯著性分析，圖形采用Origin 2018進行繪制。

2 結果與分析

2.1 接種量對竹蓀酸漿總酸的影響

接種量對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖1。

由圖1可知，接種量為2%～8%時，發酵液中總酸含量呈顯著升高的趨勢（p＜0.05），接種量8%時達到最大值4.54 g/L；而接種量為8%～10%時，發酵液中總酸含量變化不大（p＞0.05），這與陳斌等人[13]采用植物乳桿菌發酵豆干黃漿水的趨勢基本相同。此外，發酵液中OD值先顯著升高而后趨于平緩，表明接種量從2%增至4%，發酵液中活菌數激增；但接種量超過4%，活菌數增長趨緩；這可能是植物乳桿菌和酵母菌的生長繁殖受到培養環境中多糖等物質消耗、pH值降低等因素的影響[14]。由圖1可知，總酸量與菌體數量呈正相關，但是不存在顯著關系。因此，綜合考慮后確定最適接種量為8%。

圖1 接種量對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

2.2 發酵初始pH值對竹蓀酸漿總酸的影響

發酵初始pH值對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖2。

由圖2可知，發酵初始pH值為4.5～5.5時，發酵液中總酸含量和OD值均先顯著升高（p＜0.05）；初始pH值在5.5～6.0，總酸含量出現降低，OD值卻有所增加，但是2個指標的變化均不顯著（p＞0.05）；初始pH值為6.0～6.5，總酸含量顯著降低（p＜0.05），OD值則變化不大（p＜0.05），說明植物乳桿菌和酵母菌在初始pH值為5.5～6.5時生長良好，菌數相差不大，但是初始pH值越高，產酸量越低。喬明武等人[16]使用乳酸菌和酵母菌以接種比例1∶4聯合發酵黃漿水，醋酸、酒石酸、丁二酸、乳酸等有機酸含量均有不同程度的提升。結合試驗結果推測，試驗所用2個菌種有機酸代謝需在一定的酸性條件下進行，但是初試pH值過低，將抑制其生長和代謝。呂博等人[14]保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌雙菌發酵過程中，黃漿水加入乳糖，初試pH值越大，發酵液色澤越深，與試驗結果相反。綜合考慮，確定最適發酵初試pH值為5.5。

圖2 發酵初始pH值對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

2.3 發酵溫度對竹蓀酸漿總酸的影響

發酵溫度對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖3。

圖3 發酵溫度對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

溫度是菌種生長和代謝的重要條件。由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，發酵液的總酸呈現先升后降的趨勢，同時OD值呈現前期緩慢增加后降低的現象。當發酵溫度在33℃時，總酸含量達到最大值4.71 g/L；而OD值在37℃時達到最大值2.431，這可能是菌種生長和產酸所需溫度是不一致的。不過，當溫度高于37℃，發酵液的總酸和OD值均顯著下降，說明溫度過高，不僅抑制菌種的生長繁殖，而且對有機酸的代謝和積累產生副作用。茍擁軍等人[17]采用植物乳桿菌對蘋果漿進行發酵，結果表明，發酵溫度對菌體生長影響較大，發酵溫度在32.5℃時發酵液中活菌數最高。綜合考慮，確定最適發酵溫度為33℃。

2.4 發酵時間對竹蓀酸漿總酸的影響

發酵時間對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖4。

圖4 發酵時間對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，前期菌數上升速度迅猛，OD值在60 h時達到最大值2.322，隨后OD值出現明顯降低（p＜0.05），菌數大幅降低，這可能是因為隨著時間延長，大豆異黃酮等營養物質逐漸消耗，代謝產物逐步積累，制約菌種生長和繁殖，導致菌體數量下降。這與黨輝[18]的研究結果基本一致。發酵液中的總酸含量則呈現顯著升高而后趨于平緩。歐紅艷等人[19]研究表明，乳酸菌和酵母菌混菌發酵豆清飲料過程中，乳酸、檸檬酸等有機酸的生成與大豆苷、黃酮苷等大豆異黃酮的消耗有較高的相關性。另外，對山藥茯苓采用植物乳桿菌進行發酵，結果表明，相比于未發酵水提樣品，發酵液中的總多糖含量明顯更多，表明植物乳桿菌對植物原料中成分有較強的轉化能力[20]。試驗所選菌種對竹蓀多糖等成分的利用狀況有待進一步研究。綜合考慮，確定最適發酵時間為60 h。

2.5 正交試驗結果與分析

正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果

由表3可知，各因素對竹蓀酸漿總酸含量影響的大小順序為D＞B＞A＞C，即發酵時間＞發酵初始pH值＞接種量＞發酵溫度。試驗優化組合為A2B3C2D2，即接種量8%，發酵初始pH值6.0，發酵溫度33℃，發酵時間60 h。驗證試驗結果表明，在該工藝下竹蓀酸漿總酸含量為4.873±0.05 g/L，OD值為2.510±0.012，總酚含量為1.98±0.03 mg/mL，其色澤為淡黃色，酸味適中，無澀味，有竹蓀清香。

2.6 竹蓀酸漿豆腐與自然發酵酸漿豆腐品質的比較

分別以竹蓀酸漿和自然發酵酸漿作為凝固劑制作豆腐，并對獲得的豆腐品質進行評價。

竹蓀酸漿豆腐與自然發酵酸漿豆腐品質的比較見表4。

表4 竹蓀酸漿豆腐與自然發酵酸漿豆腐品質的比較

由表4可知，竹蓀酸漿豆腐色澤微黃，質地細膩、有彈性，以及水分含量、蛋白質含量等指標與自然發酵酸漿豆腐相差無幾，但是竹蓀酸漿豆腐有竹蓀清香和豆香，總酚含量更高，具有抗氧化活性，感官評分更高。因此，竹蓀酸漿豆腐既保持了傳統酸漿豆腐的質構，又增加了竹蓀風味，還具有抗氧化等保健功能的潛力。

3 結論

通過單因素試驗結合正交試驗優化了竹蓀酸漿發酵工藝：植物乳桿菌和酵母菌的接種量為8%，發酵初始pH值6.0，發酵溫度為33℃，發酵時間為60 h。該工藝獲得的竹蓀酸漿總酸含量為4.873±0.05 g/L，OD值為2.510±0.012，總酚含量為1.98±0.03 mg/mL，有益菌數量大且具有抗氧化潛力。此外，竹蓀酸漿色澤為淡黃色，酸味適中，無澀味，帶有淡淡的竹蓀清香。以竹蓀酸漿為凝固劑制得的豆腐質地細膩、有竹蓀清香和豆香，感官評分比自然發酵的酸漿豆腐更高，具有較好的市場前景。但是竹蓀酸漿抗氧化等保健功能需要后續進一步研究。研究為提高竹蓀和豆制品生產副產物的資源利用率、微生物發酵制備豆腐凝固劑提供了新的思路。