輕度發酵對沙棘汁揮發性香氣成分的影響

吳 斌，姜 蕾，候吉超，宋晶晶，吳江超

（1.喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態重點實驗室，新疆 喀什 844000）

0 引言

沙棘即醋柳、酸刺，是一種富含維C[1]、氨基酸和胡蘿卜素[2]的胡頹子科植物（Hjppophae rhamnoides L.）的成熟果實，除了豐富的營養物質之外，還具有較為廣泛的藥用價值，可用于治療心臟病、心血管疾病[3]，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀[4]、增強免疫力、抗腫瘤、抗癌[5]等功效，其食藥同源的特性也在食品和保健品開發領域得到廣泛重視，但沙棘汁由于存在不愉快氣味而很少被人接受，因此采取方法改善其風味勢在必行。酒精發酵是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）將糖轉化為酒精、高級醇和少量甘油、CO2的過程[6]，酵母菌通過自身發酵特性和代謝賦予發酵制品不同的品質[7]和風味[8]。目前，有研究采用釀酒酵母輕度發酵了沙棘汁，優化了發酵工藝，以改善沙棘汁的風味[9]，但輕度發酵對風味成分的具體影響尚不明確。

以新鮮沙棘汁為原料，通過使用酵母菌輕度發酵沙棘汁改善其風味，旨在通過輕度酒精發酵改善其不良氣味，探究輕度發酵對沙棘汁風味的影響，用商業釀酒酵母輕度發酵沙棘汁，通過HS-SPMEGC-MS技術檢測沙棘汁發酵前后的揮發性香氣成分，結合聚類分析和顯著性差異分析輕度發酵對沙棘汁的主要揮發性香氣成分的影響，以期開發一款大眾接受的輕度發酵沙棘汁飲料，促進沙棘產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘原汁，購自新疆維吾爾自治區喀什市，包裝完整無損壞，原汁無變質現象。

AWRI-796型活性干酵母，澳大利亞Mauribrew公司提供；果膠酶、偏重亞硫酸鉀，法國Lallemand公司提供；2-辛醇，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭，美國Supelco公司產品；HP-INNOWax毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、QP2020 NX型氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司產品；C-MAG HS 4型磁力攪拌器，德國IKA公司產品；頂空固相萃取裝置，美國Sigma公司產品。

1.3 輕度發酵沙棘汁

參考孫乾坤等人[9]的方法，配置3%葡萄糖的蒸餾水，煮沸冷卻至30℃后加入活性干酵母并恒溫攪拌，直至溶液中有氣體產出表明活化完成，調整菌濃度為1×106CFU/mL。添加白砂糖將沙棘汁的糖度調整為10 °Bx，原汁與水1∶1混合，然后向沙棘汁中加入50 mg/L SO2，隨后按照果汁質量的0.03%添加活化好的釀酒酵母，于28℃下恒溫發酵24 h。

1.4 揮發性香氣物質測定

1.4.1 香氣物質的提取

樣品香氣物質的提取主要參考余歡等人[10]的方法，取沙棘汁5 mL置于20 mL頂空瓶中，加入質量濃度為100 μg/mL的2-辛醇2 μL作為內標，密封頂空瓶并于45℃下加熱10 min，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45℃下吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250℃下解析5 min，進行GC-MS分析。

1.4.2 色譜條件

GC-MS分析主要參考PLESSAS等人[11]的方法，采用恒定流量模式，起始柱溫40℃，以5℃/min升至90℃；再以10℃/min升至230℃，保留7 min。載氣為純度99.99%的氦氣，流量0.8 mL/min，汽化室溫度230℃。

1.4.3 質譜條件

電子電離（Electronionization，EI）離子源，電子能量70 eV，接口溫度為250℃，離子源溫度為200℃，燈絲發射電流為100 μA，檢測器電壓1 kV。

1.4.4 揮發性物質的定性和定量分析

定性方法：通過比較質譜與NIST15質譜數據庫來鑒定化合物，保留正、反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結果。

定量方法：采用直接內標法定量，以2-辛醇作為內標（100 μg/mL），計算公式為：

式中：Cx——各組分香氣質量濃度，μg/L；

C1——內標物的質量濃度，μg/L；

M1——待測組分的峰面積；

M2——內標物的峰面積；

V1——內標物體積，mL；

V2——樣品體積，mL。

1.5 數據處理

使用Origin Pro 2017軟件作圖、SPSS 23.0軟件進行香氣物質組間顯著性差異分析（Duncan檢驗，p＜0.05）和歐式聚類分析，Microsoft Office 2016進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 發酵前后沙棘汁揮發性香氣物質的組成

沙棘汁發酵前后揮發性香氣成分總離子流圖見圖1，沙棘汁發酵前后香氣物質質量濃度比較見圖2，沙棘汁發酵前后揮發性香氣物質見表1。

圖1 沙棘汁發酵前后揮發性香氣成分總離子流圖

圖2 沙棘汁發酵前后香氣物質質量濃度比較

在發酵前后的沙棘汁中共鑒定出68種揮發性香氣物質，其中包括29種酯、13種醇、15種酸、6種醛、2種酮、3種酚。由此可見，沙棘汁中主要揮發性物質為酯類，其次是酸類和醇類。在發酵前，共檢測出64種揮發性香氣物質，其中包括29種酯、13種醇、11種酸、6種醛、2種酮、3種酚。而在發酵后的沙棘汁中，共檢測出62種揮發性香氣物質，其中包括23種酯、13種醇、15種酸、6種醛、2種酮、3種酚。從總體香氣物質質量濃度來看，經發酵后的沙棘汁酯類香氣成分質量濃度（11 747.53 μg/L）和醇類香氣成分質量濃度（5 416.75 μg/L）比發酵前有所提升，但也損失6種酯類化合物，而且還新增加了4種酸類化合物，包括異丁酸、苯甲酸和2-羥基肉桂酸等。

2.2 發酵對沙棘汁香氣成分的影響分析

2.2.1 酯類化合物

酯類物質對酒類的花果香氣具有主要貢獻[12]。由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中共檢出29種酯類物質，其中發酵前沙棘汁29種，發酵后沙棘汁23種，相較于發酵前沙棘汁（10 273.99 μg/L），發酵后沙棘汁（11 747.53 μg/L）酯類物質總含量均顯著升高。主要表現為乙酸乙酯、己酸乙酯和苯甲酸乙酯含量的上升及物質組成的差異，其中乙酸乙酯可賦予沙棘汁微帶果香的酒香氣味，己酸乙酯具有草莓、菠蘿香氣，苯甲酸乙酯具有依蘭和熱帶花香，增加了沙棘汁水果類香氣強度。同時，經過發酵后的沙棘汁酯類香氣物質種類減少了6種，分別是戊酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、肉桂酸乙酯、異戊酸異戊酯、己酸丙酯和2-糠酸乙酯，降低了沙棘汁的香氣多樣性，減少的酯類香氣物質總質量濃度為27.69 mg/L，對總體香氣強度的影響較小。

表1 沙棘汁發酵前后揮發性香氣物質

（接表1）

2.2.2 醇類化合物

釀酒酵母在酒精發酵過程中通過自身代謝生成酒精的同時會產生甘油和高級醇等副產物[13]，其中高級醇對酒類的風味具有重要作用，當質量濃度大于400 mg/L時，會有強烈的刺鼻味，而當質量濃度小于300 mg/L時，可以使香氣更具復雜性[12]。由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中共檢出13種醇類物質，總質量濃度均小于300 mg/L，相較于發酵前的沙棘汁，輕度發酵后的沙棘汁的高級醇含量均顯著增加，主要表現在乙醇、異戊醇和苯乙醇含量的增加。其中，異戊醇含量質量濃度從102.13 μg/L上升至198.55 μg/L，乙醇質量濃度從804.35 μg/L上升至1 589.75 μg/L，苯乙醇質量濃度從1 107.75 μg/L上升至1 570.47 μg/L，分別上升94.4%，97.6%，41.8%。其中，乙醇賦予了沙棘汁發酵酒香，適量的異戊醇可以增加沙棘汁的醇厚感。苯乙醇可以賦予沙棘汁玫瑰和蜂蜜氣味，同時也是威代爾冰酒的特征香氣[14]。

2.2.3 酸類化合物

沙棘汁中的酸類物質主要來源于沙棘果實和酒精發酵代謝，其中脂肪酸是主要的酸類物質，當脂肪酸氣味活度值小于1時，可以加強風味復雜性[15]。由圖2和表1可知，在沙棘汁中共檢測出15種酸類物質，其中發酵前沙棘汁11種，發酵后沙棘汁15種，從酸類物質總質量濃度角度來看，發酵前和發酵后沙棘汁差異不顯著，但輕度發酵也具有一定的降酸作用。但相較于發酵前沙棘汁，發酵后沙棘汁酸類化合物增加了4種酸類化合物，分別是異丁酸、反式-己二烯二酸、2-羥基肉桂酸和苯甲酸，多樣的酸類物質有利于沙棘汁口感的平衡。但經過輕度發酵后的沙棘汁，辛酸質量濃度顯著上升，從發酵前的140.83 μg/L上升至219.77 μg/L，上升56.1%，會給酒類帶來酸敗的味道，對酒類風味具有一定負面的影響。

2.2.4 醛類化合物

醛類物質主要來源于酒精發酵過程氨基酸在酶的作用下產生的醛。由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中共檢出6種醛類物質，相較于發酵前沙棘汁（179.43 μg/L），發酵后的沙棘汁（51.50 μg/L）中的醛類物質質量濃度顯著降低，主要表現在2,4-二甲基苯甲醛、壬醛和呋喃甲醛質量濃度的降低，其中2,4-二甲基苯甲醛具有苦杏仁味，壬醛具有脂肪和牛奶氣味，呋喃甲醛具有杏仁氣味，降低了沙棘汁的氣味強度，但同時醛類物質含量的降低也增加了發酵沙棘汁的安全性，更有益于人體健康。

2.2.5 酮和酚類化合物

由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中，共檢出3種酚類和2種酮類，從發酵前后兩類香氣物質含量和種類上來看，輕度發酵對沙棘汁的酮和酚類影響不大，總質量濃度從發酵前的76.26 μg/L上升至發酵后的77.47 μg/L，僅上升1.6%，因此輕度發酵對改善沙棘汁醛類風味物質貢獻較小。

2.3 沙棘汁發酵前后香氣物質聚類分析

沙棘汁發酵前后香氣物質聚類分析樹狀圖見圖3。

采用聚類分析評估發酵前和發酵后沙棘汁中揮發性化合物的變化。通過SPSS 16.0分析軟件，以類間平均距離法作為測量方法，以歐式距離作為度量標準，將發酵沙棘汁和未發酵沙棘汁樣品風味物質聚類成樹狀圖。由圖3可知，發酵沙棘汁和未發酵沙棘汁樣品分別被準確聚為一類：一種聚類對應于發酵前的沙棘汁樣品（before）；另一種聚類對應于發酵后的沙棘汁樣品（after）。當歐式距離增大至25.0時，發酵樣品和未發酵樣品才被聚為一類，說明發酵樣品和未發酵樣品之間相似度極低。表明發酵前和發酵后的整體揮發性風味輪廓不同，經酵母菌發酵后的沙棘汁風味改變顯著。

3 結論

通過對輕度發酵前后沙棘汁的揮發性香氣物質進行檢測分析，共檢出68種揮發性香氣物質，其中包括29種酯、13種醇、15種酸、6種醛、2種酮、3種酚。與發酵前沙棘汁相比，經過輕度發酵能夠顯著增加沙棘汁酯類香氣物質，主要是乙酸乙酯、己酸乙酯和苯甲酸乙酯，增強沙棘汁花果類香氣；輕度發酵后的醇類物質含量也高于發酵前沙棘汁，表現為苯乙醇、異戊醇和乙醇等高級醇含量的上升，賦予沙棘汁厚重的口感和玫瑰類香氣。同時，經過發酵新產生了4種酸類物質，有利于平衡沙棘汁的口感，降低了醛類物質的含量，提高了沙棘汁的安全性。因此，研究認為輕度發酵能夠顯著改善沙棘汁的風味和口感，后續工作可對輕度發酵沙棘汁工藝進行更深層次的優化，開發一款受大眾接受和喜愛的輕度發酵沙棘汁飲料。