右美托咪定通過HIF-1α對缺血性腦卒中線粒體功能的調控*

張雯 梅靜 張宇軒 李瑞軒 陳哲徐 徐桂萍

(新疆維吾爾自治區人民醫院麻醉科，新疆 烏魯木齊 830001)

缺血性腦卒中(Ischemia stroke, IS)是一種嚴重威脅中老年人健康的腦血管疾病[1-2]。目前IS主要以靜脈溶栓等方式恢復缺血區血流，但這常會伴隨再灌注損傷的風險。其機制包括活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成和釋放，線粒體凋亡途徑啟動，線粒體結構的破壞[3]。如何減輕IS治療過程中再灌注損傷已成為目前國內外研究熱點。低氧誘導因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) 是機體應對缺氧反應的重要調節因子[4]。缺氧條件下，由于線粒體呼吸鏈電子傳遞阻斷會造成ROS的大量產生，在此過程中，HIF-1α由于脯氨酰羥化酶的抑制而在細胞核中積累。然而已有研究表明，低氧環境中，HIF-1α可以通過多種途徑修復呼吸鏈損傷，轉變能量產生方式，減少細胞內ROS的產生[5]。因此，HIF-1α表達增加可能是低氧環境下機體內源性保護通路的啟動，對IS局部缺血區具有正向的調節作用。右美托咪定是一種選擇性α2腎上腺素受體激動劑，具有良好的鎮靜、鎮痛作用而被廣泛用于圍手術期的各個過程[6]。近年來研究表明右美托咪定對身體器官的缺血/再灌注損傷具有明顯保護作用，涉及線粒體功能的保護，氧化應激與炎癥反應的抑制[7-8]。然而，右美托咪定對于HIF-1α信號通路調節研究鮮少。因此，本研究擬通過腦缺血再灌注模型構建，探究HIF-1α在右美托咪定調節IS神經功能與梗死面積中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48只SPF級健康的雄性大鼠，7周齡，體質量220～250g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，動物生產合格證號：SCXK(新)2018-0001。所有大鼠飼養于SPF級動物房中，恒溫(22±2)℃，恒濕(60±5)%，日常采用日光燈采光，周期為12h，自由飲食攝水。本實驗動物的操作和處理過程全部遵守《中華人民共和國衛生部動物實驗管理條例》及《實驗動物管理規定》，并經我院倫理委員會審核批準。

1.2 實驗試劑與儀器 鹽酸右美托咪定(美國MCE公司，純度：98.54%，批號：420397)；YC-1(美國MCE公司，純度：99.48%，批號：370255)；腦缺血線栓(廣州佳靈生物科技公司，型號：L3200，批號：1020-1905)；戊巴比妥鈉(上海思域化工科技有限公司，批號：394003)，乙酰水楊酸(麥克林試劑公司，批號：M390293)，2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京索萊寶生物科技公司)溶液；線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物科技公司，批號：379843)；BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司，批號：463721)；線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成生物科技公司，批號：A350-17)；線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ試劑盒(南京建成生物科技公司，批號：A659-20)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物科技公司，批號：A673-31)；ATP檢測試劑盒(南京建成生物科技公司，批號：A932-13)；HIF-1α(武漢三鷹生物科技公司，批號：4304-1583)與β-actin(武漢三鷹生物科技公司，批號：4307-1674)。分光光度儀(上海元析儀器公司，型號：AA3800)；熒光酶標儀(美國Thermo公司，型號：Fluoroskan FL)；凝膠電泳裝置(美國Biorad公司，型號：Mini-protean Tetra)；化學發光成像儀(上海天能生物公司，型號：5200)。

1.3 實驗分組與方案 大鼠入組后隨機分為假手術組、腦缺血組、右美托咪定組、右美托咪定+YC-1組，每組12只。所有大鼠適應性喂養1周后，開展中動脈缺血/再灌注模型的構建，在中動脈封閉后，根據不同的分組腹腔注射右美托咪定或者YC-1，參考文獻中藥物劑量，右美托咪定為50 μg/kg[9]，YC-1劑量為5 mg/kg[10]。假手術組與腦缺血組大鼠腹腔注射生理鹽水，2 h后拔出線栓，恢復缺血區血流，24 h后開展神經功能評估測試。最后，處死所有大鼠，取腦組織開展腦梗死體積染色、線粒體功能評估，氧化/還原因子檢測與Western blot。

1.4 中動脈缺血/再灌注模型構建 參考文獻[11]中改進的Longa線栓法構建中動脈缺血/再灌注模型。取非假手術組大鼠麻醉(0.3%戊巴比妥鈉，腹腔注射，0.1～0.15 mL/10g)，固定于鼠板上，頸部消毒、開口并分離出左側頸動脈，夾閉頸總動脈、頸內動脈并結扎頸外動脈。頸外動脈開口，插入線栓，前進至頸內動脈約16 mm。固定線栓，待中動脈缺血2 h，麻醉大鼠(若蘇醒則補加0.1 mL戊巴比妥鈉)，拔出線栓并結扎，縫合傷口。假手術組大鼠麻醉后，分離出頸動脈血管，不插線栓。所有動物手術過程中使用保溫毯維持體溫，在術后接受鎮痛/抗炎治療(乙酰水楊酸 5 mg/kg)。參考文獻[12]中改進的神經功能缺損評分標準對再灌注24h大鼠進行神經功能評估，總分由0分至18分，其中0分代表神經功能正常，評分增加代表神經功能損傷加重。測試內容包括：提尾測試，運動測試，感覺測試，平衡測試，反射評估和不正常運動評估。

1.5 腦梗死體積占比評估 將大鼠處死，取完整腦組織，-20℃環境中冷凍變硬，切成5片，約2 mm。將切片浸潤于2% TTC溶液中，37℃避光孵育，每5 min翻動一次，共30 min。染色后，將切片按順序排列，拍照后分析梗死區面積，最終計算得出梗死體積占比。TTC染色原理是正常活細胞組織存在脫氫酶，將TTC還原成紅色甲臜化合物，但梗死區細胞死亡，脫氫酶活力喪失，無法還原TTC。

1.6 大鼠線粒體指標檢測

1.6.1 大鼠腦組織線粒體分離 腦缺血再灌注后24 h，大鼠處死后分離腦組織，按照質量∶體積=1∶4的比例加入PMSF溶液與預冷的線粒體分離緩沖液混合溶液勻漿。將勻漿液在1000 r/min條件下離心10 min，取上清液。將上清液轉移到另一個離心管中，在15000 r/min條件下離心10 min，得到沉淀即為線粒體。將線粒體沉淀以100 μL分離緩沖液重懸，通過BCA法測定線粒體蛋白濃度。

1.6.2 線粒體膜電位檢測 取新鮮分離的線粒體樣品，采用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位。用PBS洗滌線粒體樣品，取試劑盒中incubation buffer，混勻并預熱至37℃。吸取100 μL incubation buffer，加入10 μL JC-1試劑，渦旋混勻配成JC-1工作液，加入10 μg的線粒體樣品，37℃孵育15 min，混勻細胞，使用熒光酶標儀掃描激發波長550 nm，發射波長600 nm條件下紅色熒光與激發波長485 nm，發射波長535 nm條件下綠色熒光。最終結果以紅色/綠色相對熒光強度表示線粒體膜電位，比值高表明線粒體膜電位正常。

1.6.3 大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復合物活性測定 取新鮮分離的線粒體樣品，測試原理與步驟如下：復合物Ⅰ通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶(NADH-CoQ)，基于輔酶Q底物，在魚藤酮存在的情況下，通過復合物Ⅰ催化轉化成還原型泛醌，同時還原型NADH轉化為氧化型NADH，造成340 nm處吸收峰值的降低，由此測定復合物Ⅰ的活性。移取780 μL緩沖液(reagent A)至新的比色皿中，加入100 μL 反應液(regent B)，再加入20 μL底物液(reagent D)，30℃條件下孵育3 min，加入10 μg線粒體樣品蛋白，混勻后在分光光度儀下檢測，樣品活性讀數：0分鐘時(340波長讀數-380波長讀數)-3分鐘時(340波長讀數-380波長讀數)。復合物Ⅱ通常稱為琥珀酸-輔酶Q還原酶，基于琥珀酸底物，通過復合物Ⅱ的催化氧化為富馬酸，同時氧化型二氯酚靛酚(Dichlorophenal-indophenol, DCPIP)被還原，造成600 nm處吸光度值降低，由此測定復合物Ⅱ的活性。移取780 μL緩沖液(reagent A)至新的比色皿中，加入100 μL 反應液(regent B)，再加入20 μL底物液(reagent D)，30℃條件下孵育3 min，加入10 μg線粒體樣品蛋白，混勻后在分光光度儀下檢測，樣品活性讀數：0分鐘時(600波長讀數)～5分鐘時(600波長讀數)。復合物Ⅲ通常稱為輔酶Q-細胞色素C還原酶，基于還原型輔酶Q底物，在抗霉素存在的情況下，通過復合物Ⅲ的催化，轉化為泛醌或輔酶Q，同時氧化型細胞色素C轉化為還原型細胞色素C，造成550 nm處吸光值的降低，由此測定復合物Ⅲ的活性。移取870 μL GENMED緩沖液(reagent A)至新的比色皿中，加入10 μL GENMED反應液(regent B)，再加入20 μL GENMED底物液(reagent D)，室溫下靜置10 min，加入20 μL GENMED專性液(reagent E)，加入15 μg線粒體樣品蛋白，混勻后在分光光度儀下檢測，樣品活性讀數：2分鐘時(550波長讀數)～0分鐘時(550波長讀數)。

1.7 腦組織中谷胱甘肽、ROS和ATP水品檢測 取大鼠缺血區組織，按質量∶體積=1∶4加入PBS勻漿，3000 r/min條件下離心后取上清液備用。谷胱甘肽是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽，基于還原型GSH可與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應，生成一種黃色化合物，在405 nm下可以通過比色定量測定，結果以熒光強度表示。分別取一只酶管和非酶管，加入0.2 mL 1 mmol/L的GSH溶液與0.2 mL待測勻漿，37℃反應5 min，加入0.1 mL試劑一應用液，37℃反應5 min。3000 r/min條件下離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL試劑三應用液，0.25 mL 試劑四應用液液與0.05 mL試劑五應用液，混勻后室溫靜置15 min，分光光度儀在412nm條件下檢測各管OD值。由于DCFH-DA(2,7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針可以自由穿過細胞膜，當進入細胞內，會被水解為DCFH，在活性氧存在條件下，被氧化為強綠色熒光物質DCF。取勻漿后細胞懸液，加入DCFH-DA熒光探針，避光孵育30～60 min，3000 r/min條件下離心，收集細胞沉淀，PBS重懸。使用分光光度儀在激發波長502 nm，發射波長530 nm處檢測DCF熒光強度，結果以熒光強度表示。由于肌酸激酶催化ATP和肌酸生成磷酸肌酸，可以通過檢測磷鉬酸來反映ATP含量。取30 μL樣本，加入100 μL 底物I，200 μL底物Ⅱ， 30 μL 促進劑，混勻后水浴30 min。加入50 μL 沉淀劑，充分混勻后，4000 r/min離心5 min，取上清液300 μL與500 μL顯色液，混勻，室溫靜置2 min，加入500 μL終止劑，室溫靜置5 min，使用分光光度儀在636 nm處檢測各管OD值，根據標曲計算出ATP含量。

1.8 HIF-1α蛋白表達檢測 提取分離大鼠缺血區組織，按質量∶體積=1∶4加入RIPA裂解液，在冰上研磨成單細胞懸液，離心(12000 r/min, 10 min)后取上清液，加入5×上樣緩沖液，蛋白煮沸變性后開展SDS-PAGE電泳。每個樣品孔加入10 μg樣品，設置電泳分離條件為30V/30min，90V/60min，待上樣緩沖液到達膠底。截取目標蛋白條帶并開展濕法轉膜，設置轉膜條件為2mA/60min。PBST清洗，2%牛血清蛋白封閉2 h。PBST清洗，滴加檢測Anti-HIF-1α或Anti-β-actin一抗稀釋液，4℃孵育過夜。次日取出條帶，PBST清洗，孵育二抗稀釋液，滴加ECL發光液顯影，獲得條帶后使用ImageJ軟件進行分析，最終結果以HIF-1α與β-actin蛋白灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 右美托咪定對IS大鼠神經功能的影響 假手術組大鼠未進行插線栓操作，神經功能評分為0分，腦缺血組大鼠神經功能評分增加，癥狀表現為前肢屈曲，單側轉圈且在平衡木上易于跌落；與腦缺血組比較，右美托咪定組大鼠神經功能評分減少(P<0.05)。與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠神經功能評分明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分的比較Table 1 Comparison of neurological scores of rats in each group

2.2 右美托咪定對IS大鼠缺血區梗死的影響 假手術組大鼠沒有插入線栓，大腦切片TTC染色呈現為紅色，但腦缺血組缺血側腦組織展現出明顯的白色區域，即梗死區域；與腦缺血組相比，右美托咪定組大鼠缺血側梗死體積占比明顯減少(P<0.05)；然而，與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠缺血側梗死體積占比明顯增加(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦梗死區域染色Figure 1 Staining of cerebral infarct area of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死區域占比的比較Table 2 Percentage of cerebral infarct area of rats in each group

2.3 右美托咪定對IS大鼠缺血區細胞線粒體膜電位的影響 與假手術組相比，腦缺血組JC-1水平明顯降低(P<0.05)；與腦缺血組相比，右美托咪定組JC-1水平明顯增加(P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組JC-1水平明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠線粒體膜電位的比較Table 3 Comparison of mitochondrial membrane potential of rats in each group

2.4 右美托咪定對IS大鼠缺血區細胞線粒體復合物活性的影響 與假手術組相比，腦缺血組線粒體復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯減少(P<0.05)；與腦缺血組相比，線粒體復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯提高(P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組線粒體復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠線粒體復合物活性的比較Table 4 Comparison of mitochondrial complex activity of rats in each group

2.5 右美托咪定對IS大鼠缺血區GSH、ROS與ATP水平的影響 與假手術組相比，腦缺血組大鼠缺血區GSH水平增加，ROS水平明顯升高(P<0.05)，而ATP水平明顯減少；與腦缺血組相比，右美托咪定組大鼠缺血區GSH與ATP水平明顯增加，且ROS水平明顯降低(均P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠缺血區GSH與ATP水平明顯降低，但ROS水平明顯升高(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠GSH、ROS與ATP水平的比較Table 5 Comparison of GSH, ROS and ATP levels of rats in each group

2.6 右美托咪定對IS大鼠缺血區HIF-1α蛋白的影響 與假手術組相比，腦缺血組大鼠缺血區HIF-1α蛋白增加；與腦缺血組相比，右美托咪定組大鼠缺血區HIF-1α蛋白明顯增加(P<0.05)；與右美托咪定組相比，右美托咪定+YC-1組大鼠缺血區HIF-1α蛋白明顯降低(P<0.05)。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠HIF-1α蛋白表達Figure 2 HIF-1αprotein expression of rats in each group

表6 各組大鼠HIF-1α蛋白表達的比較Table 6 Comparison of HIF-1α protein expression of rats in each group

3 討論

IS是神經內科及圍手術期常見的病理損傷，常表現為口眼歪斜，半身不遂的癥狀[13]。本研究參考Longa線栓法構建了大鼠腦缺血/再灌注模型[8]，結果顯示腦缺血組大鼠出現與臨床相似的病理特征[14]，即前肢無法完全伸展，行走困難，且腦組織中出現梗死區域。因此，本研究腦缺血/再灌注模型成功模擬了IS患者溶栓后可能出現的再灌注損傷的現象。

尋找安全高效的腦保護藥對于IS的治療具有重要臨床意義。近年來，右美托咪定作為臨床麻醉過程中常用藥物，被發現具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用，但其機制尚未完全闡明[4-5]。本研究中，在大鼠腦缺血發生后，給予右美托咪定發現大鼠的神經功能評分明顯減少，且梗死體積的百分比明顯減少。

線粒體是細胞內氧化磷酸化和ATP合成的主要場所，是為細胞生命活動提供能量的重要細胞器[15]。在IS患者中，由于缺血區血流受阻，O2水平下降，線粒體呼吸鏈電子流傳遞受阻，從而產生ROS[16]。由于ROS累積會繼續攻擊線粒體，造成線粒體復合物活性的降低，在O2恢復后仍會出現線粒體呼吸鏈電子流傳遞阻滯的現象[3]。因此，研究中常報道部分IS患者恢復了血流后，會出現更嚴重的再灌注損傷的情況[17]。與此同時，再灌注損傷過程中往往會伴隨著線粒體膜電位下降，DNA損傷觸發和蛋白質和脂質氧化，最終引起細胞功能障礙或死亡。本研究中也有顯示，與對照組相比，腦缺血組大鼠缺血區ROS水平升高，且線粒體膜電位明顯降低，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性都明顯降低。與此同時，右美托咪定的干預明顯減少了缺血區ROS水平，且增加了ATP與GSH水平，此外，線粒體膜電位明顯增加，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性都明顯升高。對應著行為學指標中，右美托咪定明顯提高了腦缺血大鼠神經功能評分，且減少了大鼠的腦梗死體積占比。因此，線粒體呼吸鏈傳遞受阻是腦缺血后系列損傷的源頭和始動環節，提高線粒體呼吸鏈復合物活性是減輕再灌注損傷的繼發性關鍵因素。

已有研究證實，HIF-1α在線粒體功能障礙中的發揮正向調節作用[18]。生理條件下，HIF-1α被迅速降解，但缺氧組織中，因為氧氣濃度降低導致羥基化酶無法發揮作用，脯氨酸羥基化無法實現，進而HIF-1α無法被泛素化蛋白酶體水解，最終HIF-1α水平增加[19]。本研究也有顯示，HIF-1α在腦缺血組大鼠缺血區表達增加，且GSH水平升高。此外，在右美托咪定的作用下，HIF-1α表達與GSH水平繼續增加。因此，HIF-1α可能是缺氧環境中，機體避免氧化應激內源性保護通路的起點[20]。有研究表明，HIF-1α 在缺氧期間通過多種途徑降低 ROS 水平，包括：通過將細胞色素c氧化酶亞基 COX4-1 轉換為 COX4-2 來提高復合體 IV 的效率；丙酮酸脫氫酶激酶1將丙酮酸從線粒體中分流，而乳酸脫氫酶A的誘導將丙酮酸轉化為乳酸[21-22]。此外，在BNIP3的誘導下，觸發線粒體選擇性自噬，在溶酶體中將受損的線粒體溶解為新裂變的線粒體提供能量[23-24]。本研究結果也表明，在HIF-1α抑制劑YC-1的作用下，相比于右美托咪定組，線粒體復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性都出現了明顯的降低，與腦缺血組水平相似，且ROS水平明顯升高，而GSH水平降低。最終，行為學方面也有顯示，腦缺血大鼠神經功能評分增加，且腦梗死體積占比增加。

4 結論

HIF-1α表達上調激活了機體內源性抗氧化通路，在腦缺血后恢復血流的過程中，通過提高線粒體復合體活性，促進了呼吸鏈中電子流的傳遞，降低缺血區ROS水平，最終減少了大鼠缺血區腦死體積占比，改善了大鼠神經功能。