活血消異方對子宮內膜異位大鼠內膜容受性及CXCL12/CXCR4信號通路的作用機制*

趙秀萍 郝秀芳 朱秀娟

(北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029)

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMS)好發于育齡期婦女，是導致不孕的重要因素[1-2]。子宮內膜異位癥本身和手術均會造成不排卵、不受精或著床失敗等，其主要因素是盆腔局部環境發生惡化，卵巢功能受到損傷及子宮內膜容受性受到改變等。在臨床上子宮內膜異位癥以性交疼痛、痛經、慢性盆腔疼痛為主要癥狀[3]。臨床上治療EMS采用腹腔鏡腹部手術和藥物治療為主，有很好的療效，可降低復發率，但在一定程度上對卵巢組織造成損傷，導致卵巢儲備降低，進而對生育功能造成影響。在臨床上，治療EMS的費用相對較高，且術后恢復也相對較慢，如果術后使用激素抑制類藥物，不僅會耽誤患者的最佳生育時機，還會有復發的可能性，二次手術患者一般都難以接受[4]。目前學者對中藥治療子宮內膜異位癥的研究越來越深入，因此中藥治療子宮內膜異位癥的優勢也逐漸顯現[5]。有學者研究證實，給予子宮內膜異位癥患者活血消異方干預后發現，不孕患者的妊娠率明顯是升高，且子宮內膜異位癥大鼠體外受精-胚胎移植率及活胎率也明顯提升，由此猜測活血消異方可能是通過對免疫平衡的調節，改善卵泡發育及子宮內膜容受性來實現的[6]。CXC 趨化因子配體12(Chemokine C-X-C motif ligand 12，CXCL12)產生于基質細胞，在胚胎發育過程中介導多種細胞的形成，例如B淋巴細胞、骨髓髓系細胞、神經元等[7]。受體趨化因子CXC基序受體4(Chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4) 是趨化因子CXCL12特異性受體，在機體中廣泛表達[8]，在腫瘤的侵襲、轉移等惡性生物學活性中，CXCL12及其受體CXCR4構成的CXCL12/CXCR4生物軸學在其中起重要作用[9]，但CXCL12/CXCR4生物軸學在子宮內膜異位癥中的具體表達研究較少。本研究旨在探究活血消異方對子宮內膜異位癥大鼠子宮容受性及子宮內CXCL12/CXCR4信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗共需雌性SD大鼠50只，性成熟且健康未孕，均從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買，合格證編號SCXK(京)2012-0001。大鼠體質量為(200±20)g，SPF級，所有大鼠均飼養在動物房內，保持室內溫度恒定25℃，光照12 h一循環。所有大鼠均自由進食攝水，適應新環境7 d后進行后續實驗。本研究通過醫院動物倫理委員會審核批準。

1.2 試劑與儀器 活血消異方湯劑由柴胡10 g，制香附10 g，丹參20 g，莪術10 g，皂角刺10 g等組成，將以上生藥加入10倍水量，煎煮3次，每次1 h，合并煎液，過濾濃縮至藥物濃度為1.8 g/mL，置于4℃冰箱保存備用(北京中醫藥大學第三附屬醫院中藥房提供)；LIF、αvβ3抗體(深圳市豪帝華拓生物科技有限公司)；CXCL12、CXCR4抗體(美國R&D公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；半定量 RT-PCR 試劑盒，Western-blot 試劑盒(美國TaKara公司)；苯甲酸雌二醇(寧波第二激素廠)；注射用青霉素鈉(華北制藥有限公司)；CXCR4拮抗劑AMD3100(美國Sigma公司)；小動物麻醉機(玉研儀器廠)；包埋機(孝感宏業醫用器械有限公司)；封片機、顯微鏡、切片機、透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。

1.3 動物分組和EMS大鼠模型制備[10]將實驗大鼠隨機分假手術組10只，造模組(子宮內膜異位癥大鼠模型組)40只。于造模前2 d肌肉注射苯甲酸雌二醇，使實驗大鼠處于同一動情期，連續1周每日定時做陰道涂片檢查，觀察大鼠動情周期，一般為4～5 d，實驗選擇動情周期正常的大鼠進行。將造模組30只大鼠制備EMS大鼠模型，手術前先稱重大鼠后麻醉，置于超凈工作臺，腹部備皮，在尿道口上約1 cm處靠左側做平行于正中線長約1.5 cm的縱切口進腹，游離大鼠左側子宮，近端離左子宮角1 cm處結扎，遠端離卵巢2 cm處結扎，并結扎兩端間的子宮系膜血管，切除約1 cm長子宮段立即放入盛有無菌生理鹽水的培養皿中，用眼科剪沿系膜部剪開管狀子宮，切割成3 mm2大小的子宮碎片，共4片，注意區分肌層與內膜面，內膜面朝向腸系膜，將右側腸系膜血管豐富處用線進行縫合，檢查腹腔無出血后，腹腔留置青霉素鈉0.25 mL，再次縫合腹壁，逐層縫合皮膚關腹。分籠喂養，待所有大鼠自然蘇醒。手術后所有大鼠均肌肉注射青霉素鈉，連續3 d，每天1次，以預防術后感染。術后第二天肌肉注射苯甲酸雌二醇，以促進異位灶的生長。假手術大鼠切除右側子宮后，在結腸系膜上用4-0可吸收線縫合4個線結，相鄰線結間距離約5 mm，余處理同前。

1.4 給藥干預 在制備模型過程中兩組大鼠均無死亡。造模后30 d再次開腹檢查，驗證造模是否成功。造模成功標志是：當移植病灶形成透明、半透明囊腫，表面有血管形成且移植物呈淡褐色時說明以為病灶內有子宮內膜生長。將造模成功的大鼠分為模型組(子宮內膜異位癥大鼠模型組)、中藥組(子宮內膜異位癥大鼠模型組給予活血消異方干預治療組)、西藥組(子宮內膜異位癥大鼠模型組給予醋酸亮丙瑞林干預組)、拮抗劑組(子宮內膜異位癥大鼠模型組給予AMD3100干預組)，每組10只。拮抗劑組：該組大鼠灌胃給予100 mg/mL AMD3100干預 ；中藥組：所有大鼠均給予活血消異方灌胃，10 mL/kg，1天1次；西藥組：每只大鼠灌胃給予醋酸亮丙瑞林干預，0.04 mg/kg，1 d/次；假手術組和模型組大鼠均給予同體積的生理鹽水灌胃，1 d/次；所有大鼠均連續給藥7 d，后21 d按起始量的1/5維持。

1.5 取標本采集 各組大鼠于停藥前5 d起每日上午9時行陰道脫落細胞學涂片觀察動情周期，停藥后擇動情期將大鼠以雌雄比例2∶1合籠。合籠次日起每日定時檢查雌鼠，如發現陰栓或陰道脫落細胞涂片發現精子定位“孕鼠”，將當日記為妊娠1 d，在妊娠第4 d進行實驗標本采集。2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(35 mg/kg)，打開腹腔，將異位內膜小心取出后放入標記的包埋框，用中性福爾馬林溶液固定后用于實驗。取各組大鼠腹主動脈血3 mL，取血后迅速分離左側子宮，將子宮組織置于冰盤上，刮取內膜組織裂解后用于蛋白質印跡實驗檢測內膜上LIF和αvβ3的表達及CXCL12和CXCR4蛋白表達。

1.6 ELISA檢測血清中E2、P水平 麻醉各組大鼠后分離大鼠左側頸總動脈，取5 mL動脈血后離心10 min，取上層血清置于-80℃冰箱中保存備用。用ELISA檢測血清中E2、P含量，實驗步驟均按照試劑盒說明進行。

1.7 各組大鼠子宮內膜組織學觀察 與宮內膜組織在10%的中性福爾馬林液固定36 h，經脫水、浸蠟、包埋切片后染色，組織切片厚度為4 μm，顯微鏡下觀察各組大鼠子宮內膜組織的病理學改變。

1.8 蛋白質印跡檢測子宮內膜LIF、αvβ3蛋白及CXCL12和CXCR4蛋白表達 刮取各組大鼠子宮內膜組織于EP管中，置于-80℃冰箱中保存。組織加入RIPA裂解液、PMSF與蛋白酶抑制劑混合的混合液，50 μL/100mg組織，提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜3 h，分別加入一抗LIF、αvβ3(1∶2000)，CXCL12、CXCR4(1∶2000)，4℃過夜孵育，室溫TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗羊抗兔IgG HRP(1∶2000)37℃ 1 h，漂洗PVDF膜，使用全自動化學發光圖像分析系統掃描PVDF膜成像后以各組目的蛋白條帶光密度值與內參蛋白β-actin光密度值計算相對比值作為各組蛋白表達量。

1.9 qRT-PCR檢測子宮內膜組織中CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9 mRNA表達 取各組大鼠子宮內膜組織研磨后裂解，用TRIzol試劑提取總RNA，用分光光度法測定其含量和濃度miR-218檢測方法按照試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，檢測CXCL12、CXCR4及其下游MMP-2、MMP-9的表達水平(內參GAPDH)。反應條件：3 min+94℃預熱；循環步驟30 s+94℃，30 s+60℃，45 s+72℃，共40個循環。72℃延伸10 min，用2-△△Ct法計算最后相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

2 結果

2.1 各組大鼠血清中E2、P水平比較 與假手術組相比，模型組大鼠血清中性激素指標E2、P含量均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，西藥組和中藥組血清中性激素指標E2、P含量均不同程度升高，且中藥組E2、P含量升高的較為顯著(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中性激素指標E2、P水平比較Table 2 Comparison of serum levels of sex hormone E2 and P in each group

2.2 各組大鼠子宮內膜組織學比較 假手術組大鼠子宮壁結構完整，子宮內膜腺體密集，腺管增生、擴張迂曲，上皮細胞呈高柱狀，管腔內可見分泌，間質細胞排列疏松；模型組大鼠子宮內膜腺體稀少，腺腔較直并且狹小，血管數量減少；與模型組相比，西藥組和中藥組大鼠子宮內膜組織均得到了明顯改善，間質輕度疏松，血管輕度增生，且中藥組情況明顯好于西藥組，見圖1。

圖1 各組大鼠子宮內膜組織病理學比較(HE染色，40×)Figure 1 Histopathological comparison of rat endometrium in each group

2.3 各組大鼠子宮內膜LIF、αvβ3蛋白表達比較 模型組大鼠子宮內膜中LIF、αvβ3蛋白表達明顯低于假手術組(P<0.05)；干預后的西藥組和中藥組中的LIF、αvβ3蛋白表達明顯升高，且中藥組升高較為顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠子宮內膜中LIF、αvβ3蛋白表達Figure 2 Expression of LIF and αvβ3 protein in the endometrium of rats in each group注：A. 4組大鼠子宮內膜中LIF、αvβ3蛋白表達；B. 4組大鼠子宮內膜中LIF、αvβ3蛋白表達比較。與假手術組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05；與西藥組相比，③P<0.05

2.4 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達比較 模型組子宮內膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白較假手術組表達明顯增多(P<0.05)；干預后的西藥組、中藥組和拮抗劑組大鼠子宮內膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達均明顯低于模型組，中藥組和拮抗劑組大鼠CXCL12和CXCR4蛋白較西藥組降低的更為顯著(P<0.05)，說明活血消異方可抑制CXCL12和CXCR4蛋白的活性，與CXCR4抗結劑具有相似的作用機制，見圖3。

圖3 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達比較Figure 3 Comparison of CXCL12 and CXCR4 protein expression in rat endometrial tissues in each group注：A. 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達；B. 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達比較。與假手術組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05；與西藥組相比，③P<0.05

2.5 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9mRNA表達比較 與假手術組CXCL12(0.61±0.23)、CXCR4(0.21±0.11)、MMP-2(0.50±0.03)、MMP-9(0.50±0.02)相比，模型組大鼠子宮內膜組織中CXCL12 (1.35±0.58)、CXCR4 (0.76±0.32)MMP-2(0.85±0.04)、MMP-9(0.98±0.05)表達均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，西藥組CXCL12(1.04±0.36)、CXCR4 (0.54±0.24)、MMP-2(0.76±0.03)、MMP-9(0.83±0.03)表達，中藥組CXCL12(0.85±0.38)、CXCR4 (0.42±0.26)、MMP-2(0.62±0.02)、MMP-9(0.65±0.02)表達，拮抗劑組CXCL12(0.80±0.36)、CXCR4(0.39±0.25)、MMP-2(0.65±0.02)、MMP-9(0.67±0.02)表達均顯著降低，且中藥組和拮抗劑組較西藥組降低的較為顯著(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12、CXCR4 、MMP-2、MMP-9mRNA表達比較Figure 4 Comparison of mRNA expressions of CXCL12, CXCR4, MMP-2 and MMP-9 in endometrial tissues of rats in each group注：A. 各組大鼠子宮內膜組織中CXCL12、CXCR4 mRNA表達比較；B. 各組大鼠子宮內膜組織中MMP-2、MMP-9mRNA表達比較。與假手術組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05；與西藥組相比，③P<0.05

3 討論

子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，異位病灶的上皮和間質細胞內不但有雌孕激素受體的表達，而且還有合成甾體激素的芳香化酶，病灶組織不僅對體循環中的雌激素發生反應，而且自身也能產生雌激素，形成局部高雌激素狀態，通過改變細胞因子分泌，黏附分子的表達等途徑促進異位病灶的生長，和巨噬細胞相互作用，進而對病灶的生長、增殖有一定促進作用[11-12]。同時有研究發現EMS患者的在位及異位內膜在體外孕酮作用下均表現為增長的趨勢，這與正常內膜的反應相反[13]。推測因孕激素受體表達方式改變而使孕激素的抑制和促分化作用減弱或消失，從而不能抑制異位灶的生長。因此探究EMS模型大鼠體內雌孕激素在發病前后的變化對于研究EMS的病理本質有重要的意義。

中醫范疇學中，把子宮內膜異位癥歸為“痛經”、“不孕”等，其中“血瘀”是中醫中公認的子宮內膜異位癥發病機制，也是導致其不孕的重要病理因素[14]。淤血占據血室，或逆流于胞宮之外或蘊結于腸膜脈絡肌肉之間，瘀血阻滯下焦少腹，影響沖任的正常功能，導致沖任功能發生失調，進而會發生月經失調、腹痛及攝精失敗等，治療多以活血化瘀為準繩[15]。活血消異方重用丹參、赤芍、莪術以活血化瘀，散潔消癥，加用香附、柴胡等宣暢氣機、疏肝解郁之品，使氣行血暢，瘀血可除[16]。本研究結果顯示，活血消異方治療后大鼠血清中E2、P含量明顯升高，可見活血消異方對EMS大鼠體內的性激素指標有明顯的調節作用。

子宮內膜容受性的改變及形成受多種不同的因素所調節。整合素是細胞表面的黏附分子，主要由α、β兩亞單位構成，有粘附和信號傳遞兩大基本功能[17-18]。有研究顯示，子宮內膜整合素αvβ3發生異常表達時會發現著床失敗，當改善αvβ3的表達時會發現妊娠的結局也得到明顯改善。因此，整合素αvβ3作為子宮內膜容受性建立的衡量標志已被國內外廣大學者認可，其高表達對促進受態子宮內膜的建立具有重要意義。在判斷內膜對胚泡是否有容受性及胚泡是否著床時，可根據著床窗口期 LIF 在子宮內膜的表達來進行判斷。本研究結果顯示，αvβ3和LIF蛋白在子宮內膜異位癥大鼠中表達降低，可見在子宮內膜異位癥大鼠體內αvβ3發生了異常的表達，LIF表達降低，說明大鼠子宮內膜容受性也同時被降低，進而降低了子宮內膜對胚泡的容受性。活血消異方干預后發現αvβ3和LIF蛋白表達得到了明顯的回升，提示活血消異方對子宮內膜異位癥大鼠的子宮內膜容受性有明顯的改善作用。通過對子宮內膜異位癥小鼠給予活血消異方干預，發現其對讓小鼠圍著床期子宮內膜著床因子整合素αvβ3和LIF的表達量顯著增加，進而對EMS小鼠的子宮內膜容受性進行改善。

CXCL12/CXCR4是近年來研究較多的與腫瘤發病相關的因子，CXCL12會和CXCR4結合成為生物軸學，進而影響腫瘤細胞的惡性生物學活性，其也是腫瘤發生轉移及形成的先決條件[19-20]。子宮內膜異位癥的生物學特性與惡性腫瘤極為相似。基質金屬蛋白酶(MMPs腫瘤)在腫瘤侵襲和轉移中發揮關鍵作用，有學者研究發現CXCR4、CXCL12相互作用可調節MMPs表達，且在癌細胞的侵襲和轉移中發揮巨大作用[21-22]。本研究結果發現子宮內膜異位癥大鼠體內CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9表達明顯升高，活血消異方干預后的中藥組大鼠子宮內膜中CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9表達得到了顯著的抑制，且中藥組與拮抗劑組大鼠CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9表達水平無顯著差異，均較低于西藥組，說明活血消異方可抑制CXCL12、CXCR4、MMP-2、MMP-9蛋白的活性，與CXCR4抗結劑具有相似的作用機制，推測活血消異方可通過抑制CXCL12/CXCR4信號，抑制MMP-2、MMP-9表達進而改善子宮內膜異位癥。姚燕婷等[23]研究證實，SDF-1、CXCR4可能通過參與子宮內膜增殖，侵襲過程而導致不孕發生。

4 結論

活血消異方對子宮內膜異位癥大鼠子宮內膜容受性進行有效的改善，同時可抑制子宮內膜異位癥大鼠CXCL12、CXCR4表達。