外周血循環腫瘤細胞檢測與胰腺癌化療反應及腫瘤復發轉移的關系*

劉嬌 盧熹微 曹軍麗 鄭磊 徐紅梅

(秦皇島市第一醫院腫瘤科，河北 秦皇島 066000)

近年來，全球胰腺癌發病率呈逐年升高趨勢，且患者5年生存率低至6%[1-2]。現階段，臨床主要采取手術方式治療胰腺癌，但患者術后復發轉移及死亡風險仍較高[3]。有報道稱，術后輔助化療能夠有效延長胰腺癌患者生存時間[4]。故臨床已將手術切除聯合術后輔助化療方案作為胰腺癌標準療法，盡管予以術后輔助化療，依然有部分患者存在復發轉移風險，導致預后不良[5]。以往研究表明，循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)發生早期微轉移是腫瘤復發轉移重要環節[6]。CTCs主要指從原位腫瘤或繼發腫瘤病灶脫落之后進入血液循環系統的腫瘤細胞，其能通過血液循環系統造成微轉移或者引發微小癌栓，在一定條件下能夠進展為轉移癌。近年來，人們越來越關注CTCs在腫瘤早期診斷、病情及預后評估中的檢測價值。相關研究稱，CTCs屬于腫瘤患者預后影響因素及靶向治療過程中重要標志物[7]。隨著現代細胞檢測方式與鑒定技術不斷發展，通過外周血CTCs檢測進行胰腺癌診斷、臨床療效評估與患者預后判定逐漸成為可能。當前，關于外周血CTCs與胰腺癌化療反應的研究較少。本文主要探究外周血CTCs與胰腺癌患者化療反應及腫瘤復發轉移的關系，希望為臨床提供可靠指導依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年2月～2019年10月我院收治的胰腺癌患者100例。納入標準：①經病理確診為胰腺癌。②具有正常認知，意識清晰。③對研究知情，簽署研究知情同意書。排除標準：①以往有胰腺癌手術、靶向治療或者放化療史。②其他部位惡性腫瘤患者。③合并自身免疫性疾病或者血液系統疾病。④發生遠處轉移。同時選取健康體檢者(體檢結果正常)與胰腺良性疾病患者各30例，其中胰腺良性疾病包括急性胰腺炎20例，慢性胰腺炎8例，胰腺囊腺瘤2例。本研究經我院倫理委員會審批。

1.2 方法 胰腺癌患者均行手術切除(達到R0切除)與術后輔助化療，化療方案為：第1 d、第8 d、第15 d，采用靜脈滴注予以吉西他濱(國藥準字號：H20030104，生產廠家：江蘇豪森藥業集團有限公司)1000 mg/m2，每28 d治療是1周期。對患者隨訪1年，記錄生存情況。分別在患者術前與術后7 d(化療前)，抽取胰腺癌患者外周靜脈血7.5 mL，采取陰性富集聯合免疫熒光染色體原位雜交法(FISH)檢測CTCs，將富集后細胞均勻抹于玻片上，通過八號染色體擴增探針以及白細胞表面抗原有效標記CD45-A1exa594，然后行免疫熒光染色處理，于熒光顯微鏡下，采用雙免疫標記法進行富集細胞樣本的分析。CTCs陽性判定[8]：單個細胞核4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色陽性，同時細胞核沒有重疊；無血源性白細胞上有抗原紅圈著色；單個細胞核里面8號染色體呈現異常擴增現象，異常FISH信號點不少于3 個，且于40 倍鏡下發現信號不重疊。化療效果評估參照影像學RECIST標準[9]，完全反應(CR)：患者目標病灶消失，維持時間≥4周；部分反應(PR)：患者基線病灶長徑和減短≥30%，維持時間≥4周；疾病穩定(SD)：患者基線病灶長徑和盡管有所變小，但沒有達到PR或變大未達PD；疾病進展(PD)：患者基線病灶長和變大≥20%或有新病灶產生。其中客觀緩解：PR+ CR；疾病控制：PR+ CR+SD。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計數資料表示為“頻數與頻率”，以2檢驗；計量資料均經正態分布檢驗，以表示，多組比較使用單因素方差分析法；生存分析使用Kaplan -Meier生存曲線；使用Logistic回歸模型分析腫瘤分期、分化程度與CTCs陽性的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者性別、年齡及體重指數(BMI)等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data of three groups

2.2 3組患者CTCs陽性率比較 胰腺癌組CTCs陽性率明顯高于良性疾病組與對照組(P<0.05)，見表2。

表2 3組患者CTCs陽性率比較[n，n(×10-2)]Table 2 Comparison of CTCS positive rate among three groups

2.3 不同臨床特征患者CTCs陽性率比較 不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑及有無淋巴結轉移患者CTCs陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)；腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化患者CTCs陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高/中分化患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征患者CTCs陽性率比較[n，n(×10-2)]Table 3 Comparison of positive rates of CTCS in patients with different clinical features

2.4 腫瘤分期、分化程度與CTCs陽性的關系 Logistic回歸分析顯示，胰腺癌患者腫瘤分期、分化程度與CTCs陽性有關(P<0.05)，見表4。

表4 腫瘤分期、分化程度與CTCs陽性的關系Table 4 Relationship between CTCs positive and tumor stage and differentiation

2.5 不同化療療效患者術后CTCs陽性率比較 術后CTCs陽性37例，化療客觀緩解42例(42.00%)，疾病控制71例(71.00%)，疾病控制患者CTCs陽性率明顯低于疾病進展患者(P<0.05)，見表5。

表5 不同化療療效患者術后CTCs陽性率比較[n，n(×10-2)]Table 5 Comparison of postoperative CTCs positive rate in patients with different chemotherapy efficacy

2.6 患者預后情況 中位隨訪時間為9.87個月，術后CTCs陽性患者生存9例(24.32%)，死亡28例(75.68%)，復發轉移30例(81.08%)；陰性患者生存26例(41.27%)，死亡37例(58.73%)，復發轉移42例(66.67%)；Kaplan -Meier生存分析發現，CTCs陽性患者1年生存率明顯低于CTCs陰性患者(2=5.114，P=0.024)，CTCs陽性患者1年內復發轉移率明顯高于CTCs陰性患者(2=4.479，P=0.034)。見圖1、圖2。

圖1 總生存分析Figure 1 Total survival analysis figure

圖2 無進展生存分析Figure 2 No progress survival analysis

3 討論

本研究顯示，胰腺癌組CTCs陽性率較高于良性疾病組，明顯高于對照組，表明胰腺癌患者CTCs陽性率呈異常升高趨勢。以往研究指出，CTCs檢測結果和腫瘤分化程度與患者預后存在密切相關性[10-11]。本研究經Logistic回歸分析發現，胰腺癌患者腫瘤分期、分化程度與CTCs陽性有關，與上述研究結果基本一致，證實外周血CTCs陽性表達影響因素主要為腫瘤發展至晚期、低分化，可能與CTCs繼承了相應腫瘤干細胞較高侵襲性與轉移潛能有關。本研究發現，淋巴結轉移與胰腺癌患者外周血CTCs表達無關，分析原因可能是腫瘤病灶和淋巴結轉移在其血運行轉移原理上存在較大差異，后者主要通過人體淋巴系統管道而產生逐站以及跳躍式轉移，因此轉移的腫瘤細胞能夠不經血液循環系統。相關研究表明，腫瘤直徑與CTCs檢測結果存在顯著相關性，直徑越大，則其水平越高[12]。本研究則顯示腫瘤直徑與胰腺癌患者外周血CTCs無關，與上述研究觀點不一致，可能與本次研究樣本較少，存在一定局限性有關。

有研究指出，腫瘤患者CTCs里面Toll樣受體/髓樣分化因子88(TLRs/myd88)信號通路和其化療效果存在緊密聯系[13]。以往關于外周血CTCs表達與胰腺癌化療效果關系的研究少，此為本次研究創新性分析點。本研究中，疾病控制患者CTCs陽性率明顯低于疾病進展患者，提示CTCs陽性患者術后輔助化療效果較差。可能由于TLRs能夠在CTCs中表達，而TLRs能夠對腫瘤細胞凋亡產生抑制作用，加快腫瘤細胞侵襲及轉移，同時避免部分CTCs被機體免疫系統識別并且清除。有研究對胰腺癌手術患者進行5年隨訪，發現其中位生存時間只有12～20個月[14-15]。本研究顯示，胰腺癌患者1年總體生存率35.00%，CTCs陽性患者為24.32%，明顯低于陰性患者41.27%，表明胰腺癌術后生存率偏低，特別是CTCs陽性患者。大部分胰腺癌患者臨床診斷時已發展至中晚期，并且病灶惡性程度高，因此相較于其他消化系統腫瘤，胰腺癌患者生存率更低[16]。有研究稱，復發轉移為胰腺癌患者治療失敗主因[17]。以往有研究對乳腺癌患者進行觀察，發現治療前CTCs 顯示陰性的患者無進展生存期與總生存期均優于CTCs陽性患者，且連續動態檢測CTCs數>5個者，具有較高復發/轉移風險[18]。本研究中，CTCs陽性患者術后復發轉移率較CTCs陰性患者明顯更高，表明外周血陽性與胰腺癌患者術后復發轉移密切相關。還有研究稱，CTCs一般因腫瘤發展至晚期而被迫進入相應體循環，從而使外周血中可以檢測到CTCs，其為血液中微轉移主要方式，可以形成新轉移灶[19]。現階段的研究表明，腫瘤遷移性一般是雙向的，人體多種癌細胞(包括黑色素瘤、乳腺癌以及結腸癌等)內均有原位種植現象[20]。或許原位種植現象可以解釋CTCs與胰腺癌患者術后復發轉移的關系。與傳統組織學以及影像學檢查相比，外周血CTCs檢測對人體近似無創，可以動態監測患者腫瘤變化情況，方便進行療效以及術后復發轉移評估，從而為臨床治療提供可靠指導。

4 結論

綜上所述，胰腺癌患者腫瘤分期、病灶分化程度與外周血CTCs表達存在密切聯系，CTCs陽性患者術后輔助化療反應較差，更容易出現復發轉移或者死亡事件，臨床可通過其檢測有效評估患者病情、化療效果及預后。關于CTCs影響胰腺癌患者化療效果及腫瘤復發轉移的具體機制，有待后續大樣本、多中心研究進一步補充與完善。