絲素調控磷酸鈣晶體的生長過程研究

2022-09-26 06:39:58曹金平徐曉春趙瑞波崔福齋孔祥東

絲綢 2022年9期

曹金平, 徐曉春, 趙瑞波, 崔福齋, 孔祥東

(1.浙江理工大學材料科學與工程學院,杭州 310018; 2.清華大學材料學院,北京 100084)

人類骨骼中的主要成分是膠原和磷酸鈣?；谀７绿烊还浅煞趾徒Y構的仿生思路,在膠原調制磷酸鈣礦化基礎上制備的骨植入材料近年來已經被廣泛地發展[1-3]。有機基質調制生物礦化研究也成為化學、生物、材料及醫學研究熱點,在有機基質調制磷酸鈣礦化的研究中發現,有機質相對分子質量、分子結構、反應物質量分數等條件會影響體系中磷酸鈣晶體的生長過程,并影響最終復合材料的結構、性能[4-7]。在生物材料研究中,還需考慮材料在生物體內的生物相容性和可降解性能[8-11]。絲素蛋白作為一種天然的絲蛋白,表現出優異的人體生物安全性,被廣泛應用于生物復合材料的制備[12-13]。在對磷酸鈣/絲素體系的研究中,選用的絲素蛋白為天然蠶絲的纖維織物或蠶絲纖維機械粉碎后的超細粉體[14-17],由于天然蠶絲是具有β折疊結構的高分子,相對分子質量達到30萬,在體內難以降解,不能用來開發對降解速度有嚴格要求的多種組織工程材料,此外,超細蠶絲粉體中由于含有生物相容性較差的絲膠蛋白,用其開發的材料仍不能用作醫用材料[18]。盡管不同性質的絲素蛋白用于調控磷酸鈣礦化的研究已較深入,但絲素蛋白在溶液體系中作為有機基質調制磷酸鈣晶體生長過程的研究尚未探明。

本研究以水解方法獲得的水溶性絲素蛋白作為有機基質,選用相對溫和的生物礦化環境,對絲素調制磷酸鈣晶體生長的過程進行研究,最終制備出一種微米級羥基磷灰石/絲素(簡寫為HA/絲素)復合材料。該方法是在絲素蛋白分子自組裝的同時制備復合材料,遵循了生物自組裝的思路,制備的材料有望具有良好的生物學性能,并采用紅外光譜就絲素蛋白對羥基磷灰石晶體生產過程進行細致分析。

1 實驗

1.1 試劑與材料

試劑:Na2CO3、CaCl2、NaH2PO4、NaOH,均為分析純(北京化學試劑有限公司)。

絲素蛋白溶液制備:家蠶蠶繭在0.5%的Na2CO3溶液中脫去絲膠,每次脫膠時間為30 min;將脫膠后得到的絲素用去離子水清洗后,80 ℃烘干;然后在質量分數為42%的沸騰CaCl2溶液中溶解10 min;將所得溶液在4 ℃的去離子水中透析3 d,去除鹽分;將得到的溶液經濃縮、離心后,4 ℃保存。

冷凍干燥絲素蛋白制備:取部分上述溶液冷凍干燥后用作對照。

1.2 方法

100 ℃條件下,在2 700 mL的30 mmol/L CaCl2溶液中溶解4.07 g絲素蛋白(絲素蛋白的相對含量為羥基磷灰石理論產量的50%)[18],冷卻至室溫,用0.5 mmol/L的NaOH調節pH值至8.0左右;將1 620 m的30 mmol/L NaH2PO4溶液逐滴加入反應溶液中,整個反應過程中溶液需要不斷攪拌,并維持反應的pH值在8.0左右。每隔0.5 h從反應體系中取出150 mL溶液進行抽濾,收集顆粒沉淀物并以去離子洗滌,標記為CaP-SF;不添加絲素蛋白的反應體系合成的顆粒沉淀物標記為CaP-0。所獲得樣品經冷凍干燥后,研磨成粉。

1.3 測試分析

1.3.1 傅里葉紅外光譜分析(FTIR)

采用溴化鉀壓片法分別將樣品CaP-SF、CaP-0按質量比1︰100與溴化鉀粉末混合,充分研磨后壓片(30 MPa,45 s)。利用SpectrumGx傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Electron Corporation)進行化學官能團分析,分辨率0.3 cm-1,掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.2 熱重分析(TG)

在流動的氮氣氣氛下,利用TGA2050熱重分析儀(日本Hitachi公司),分別分析樣品CaP-SF、CaP-0的有機物與無機物的含量百分比及其分解溫度,其中升溫速率為20 ℃/min,測定的溫度范圍為30～800 ℃。

1.3.3 場發射掃描電鏡分析(FE-SEM)

將樣品用無水乙醇超聲分散后,噴金。采用LEO-1530熱場發射掃描電鏡(日本Hitachi公司)先對樣品進行形貌觀察,電壓為3 kV;再對材料進行能譜分析,電壓為10 kV。

2 實驗分析

2.1 傅里葉紅外光譜結果分析

圖1 不同反應時間的CaP-0和CaP-SF的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of CaP-0 and CaP-SF in different reaction times

由圖1(a)可見,隨著反應時間的延長,各相關基團對應的吸收峰所在位置幾乎沒有發生變化,但吸收峰強度略有降低。HA是磷酸鈣熱力學上最穩定的相,盡管CaP-0中的沉淀最終也能夠轉變為HA,但是需要16 h以上才能夠完全轉變為HA。

從圖1(b)(c)可以看到,反應5.5 h前,CaP-SF樣品中酰胺Ⅱ的強度呈不斷增加的趨勢,而反應5.5 h后樣品譜線的強度則又呈現降低的趨勢。本研究認為:5.5 h前的樣品中,共沉淀物中蛋白質的含量是不斷增加的,引起酰胺Ⅱ的強度增加;5.5 h后的樣品中,由于蛋白質與HA晶體發生強烈的相互作用,有更多的HA晶體與蛋白質結合,N—H平面彎曲和C—N的伸縮振動受到較大程度的抑制,從而引起酰胺Ⅱ強度降低。

2.2 熱重結果分析

圖2是CaP-0和CaP-SF在不同反應時間的TG曲線和DTG曲線(TG曲線的微分曲線)。從CaP-0的TG曲線中可見(圖2(a)),不同反應時間的曲線相似,在145～213 ℃急劇下降。該范圍內CaP-0樣品的質量減少了約20%,與DCPD分子內含21%的結晶水的比例非常接近,因而此處主要是由于DCPD分子內的結晶水分解造成的熱失重。由圖2(a)TG曲線中還可以看到,不同反應時間的樣品在700 ℃時殘余質量百分比不同。隨著反應時間的加長,剩余樣品的質量百分比略微升高,表明隨反應的進行,樣品中DCPD的含量有減少趨勢。由此可證明,反應過程中DCPD會發生部分晶相轉變,生成了含有結晶水比例更低或者不含結晶水的磷酸鈣。從圖2(a)DTG曲線上可以看到,CaP-0樣品中DCPD的最大分解溫度出現在(188±1) ℃附近,此時CaP-0樣品的失重速度最快。另外,從圖2(a)DTG曲線上還可以看到,CaP-0樣品在430 ℃左右有一處吸熱峰,該處的吸熱峰是由于CaHPO4發生化學反應,生成了焦磷酸鈣(Ca2P2O7)的緣故。

圖2 不同反應時間的CaP-0和CaP-SF的TG及DTG曲線Fig.2 TG and DTG curves of CaP-0 and CaP-SFin different reaction times

從CaP-SF樣品的TG曲線和DTG曲線上可以看到(圖2(b)),在40～60 ℃曲線上有一個與空氣揮發有關的峰,最大揮發溫度隨樣品中HA含量的增加而升高?？梢酝茢?這是由于隨著反應的進行,在CaP-SF中生成的磷酸鈣/絲素復合物尺寸減小,空隙度增加,從而加大了對空氣的吸附力度。在100 ℃左右,曲線上有一水分蒸發形成的峰。在145～208 ℃顯示了DCPD的分解峰,DCPD的最大分解溫度在(179±2) ℃,比CaP-0樣品中的分解溫度要低6～10 ℃。

而且隨著樣品中生成HA含量的增多,最大分解溫度呈現弱的降低趨勢。在270～390 ℃的峰,是由于磷酸鈣/絲素復合物中絲素蛋白的分解造成的。絲素蛋白作為有機基質,在高溫下蛋白質會發生肽鍵裂解和氨基酸側鏈基團的分解。相關文獻中記錄絲素蛋白的最大分解溫度為290 ℃左右,然而圖2(b)的DTG曲線顯示絲素蛋白的最大分解溫度出現在340 ℃,分析認為是由于磷酸鈣與絲素蛋白形成的化學鍵合作用增強了絲素蛋白的溫度耐受性。CaP-SF樣品的DTG曲線上也能夠看到430 ℃左右的吸熱峰,但隨著反應時間的增加,樣品中DCPD的含量不斷減少,生成的CaHPO4數量也隨之減少,在該處吸熱峰的強度也就不斷降低了。

根據CaP-SF樣品在不同溫度范圍內的失重情況,計算出樣品中各成分的相對百分含量,如表1所示。計算結果表明,不同沉積時間的CaP-SF樣品中除少量的水分,還含有數量不等的絲素蛋白。在反應5.5 h前的樣品中,絲素蛋白的含量呈現逐漸增加的趨勢;在反應5.5 h后的樣品中,其含量則相對穩定,維持在14.3%左右。這個結果進一步證明了絲素蛋白與磷酸鈣發生共沉淀,此外,樣品中絲素蛋白含量變化對應FTIR圖譜中酰胺Ⅱ強度的變化趨勢。

表1 不同反應時間的CaP-SF中各成分的相對百分含量Tab.1 Relative percentage of each component inCaP-SF in different reaction times

從表1可以看出,在反應初期得到的樣品中無機相DCPD的相對含量高達85.6%,隨著反應時間的推移,樣品中DCPD的含量逐漸下降;反之,HA在樣品中的含量逐漸增加,在反應10 h后的樣品中,HA的含量達到了75.8%。而上述TG分析的結果顯示,反應2.5 h的CaP-SF樣品中DCPD以外的結晶相已達17.4%,這些結晶相被認為是HA或者HA的前體物(表1中均以HA計)。

2.3 場發射掃描電鏡結果分析

在做掃描電鏡形貌觀察時,發現CaP-0樣品主要是大的片層結構。圖3(a)(b)僅列了反應時間為0.5 h和10.0 h時CaP-0樣品照片。從圖3(a)(b)可以看到,CaP-0樣品中的磷酸鈣主要以薄片狀DCPD的形式存在,晶體的長度與寬度遠遠大于晶體的厚度,電鏡下觀察時發現有的DCPD的結晶片長度可以達到200 μm,呈現典型的DCPD晶體的形貌結構。只是隨著反應的不斷進行,生成的晶體的表面發生了部分變化。如圖3(a)中,DCPD表面比較平整,并有少量無定型的磷酸鈣附著;圖3(b)中,DCPD結晶片的表面已經開始變得粗糙,表面是細小的顆粒物沉積,可能是晶相開始發生轉變的征兆。

圖3 不同反應時間的CaP-0和CaP-SF的SEM照片Fig.3 SEM images of CaP-0 and CaP-SF in different reaction times

圖3(c)(d)是反應時間為0.5 h和2.5 h時CaP-SF樣品的照片,可以看到磷酸鈣形貌發生了較大的變化。在圖3(c)中的DCPD雖然多數呈片狀結構,但是由于受到溶液中蛋白基質的影響,晶體的厚度要比CaP-0中大得多。圖3(d)中的CaP-SF樣品,雖然其中的磷酸鈣仍然以DCPD為主,但是片狀DCPD晶體的表面有許多呈現一定走向的磷酸鈣沉積。掃描電鏡EDS能譜分析發現,該區域的Ca/P為1.05左右,與實際DCPD中的Ca/P比數據也是相當接近的。同時,樣品中新出現了一些不規則的顆粒狀磷酸鈣,是DCPD發生晶相轉變后形成的新的物相的磷酸鈣。EDS能譜分析表明,顆粒狀磷酸鈣的Ca/P為1.33,與磷酸八鈣(OCP)的數據是一致。同時樣品中均含有較高含量的碳元素(15.22%±3.7%),表明樣品中的磷酸鈣與絲素是復合在一起的,并不能將它們從形貌上區別開來。

3 結果討論

分析上述研究結果可知,絲素蛋白對磷酸鈣結晶過程起了控制作用,顯著地促進了磷酸鈣的晶相轉變,形成了磷酸鈣/絲素復合物。

1) 在制備實驗樣品時,有一個從混濁溶液中抽濾分離沉淀的過程。在過濾CaP-SF反應初期的沉淀物時,過濾速度非常快,而隨著反應的進行,利用抽濾方法使水與沉淀物分離的速度越來越慢。研究結果反應的沉淀尺寸變化可以很好地解釋實驗時的現象:由于反應生成的沉淀物的顆粒尺寸不斷變小,聚集度逐漸增加,在濾紙底層形成一層致密的膜,限制了水分子流動速度。

2) CaP-SF樣品的SEM照片顯示了磷酸鈣/絲素復合物的外部形態結構有一個明顯的演變過程,與CaP-0中的樣品相比,這種演變說明絲素蛋白作為有機基質對磷酸鈣的晶體生長產生了重大的影響。通過前文的FTIR結果可以知道,CaP-SF最終的樣品中無機相的成分主要是羥基磷灰石,它與絲素蛋白通過化學鍵合形成了復合物,最終CaP-SF樣品中出現了大量微米級的磷酸鈣。

4) 本研究肯定了絲素蛋白在調制生物礦化過程中所起的作用,雖然絲素蛋白中羧基含量較少,但是蛋白質肽鍵上含有豐富的羰基及其他極性基團,這些基團在水溶性絲素中能夠充分暴露,當與Ca2+結合后可以促進形核作用。另外,蛋白質多肽鏈中的極性氨基酸殘基也會影響生物礦化過程。這些極性氨基酸殘基如天門冬氨酸、精氨酸、谷氨酸等并非均勻地分布在多肽鏈上,而是以一種極性團簇的形式存在,它們也能夠結合一定數量的鈣離子并促進形核作用,繼而降低了產生HA晶體所需要的活化能。由于反應溶液中含有較高濃度的絲素蛋白,有大量晶核可以形成,大量晶核的存在消耗了溶液中的大量鈣離子,限制了HA晶體的進一步長大,使其維持在微米尺度。

磷酸鈣體系極為復雜的一個原因是其存在多種結晶相。羥基磷灰石是磷酸鈣熱力學上最穩定的相,但它在溶液中的析出通常伴隨若干前體相的沉淀,如無定型磷酸鈣。不同溶液條件下形成的前體相類型也不同。反應2.5～7.5 h的CaP-SF樣品的SEM結果中發現除了DCPD,還有OCP的存在,但這并不影響得出肯定的結論,即最終CaP-SF樣品中磷酸鈣的結晶相主要是HA。因為本研究所用的溶液中具有較高的離子強度和較強的堿性,在此條件下,DCPD較先產生,隨后進一步轉化為OCP,最終轉化為熱力學穩定的HA。