基于非靶向代謝組學的藍莓酵素和沙棘酵素代謝產物特征比較

姚沛琳，劉夢茹，楊 澳，蔣家璇，姚 坤,

（1.宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000；2.宿州市天然產物與功能性食品工程技術研究中心，安徽宿州 234000）

水果酵素是以新鮮水果為原料，加入糖類物質，在不控溫的條件下，經多種有益微生物通過較長時間發酵而得到的功能性微生物產品。水果酵素中含有多種有益營養物質，包括黃酮醇、類黃酮、花青素等多酚類物質，蘋果酸、檸檬酸、乳酸等有機酸物質，多種活性酶類以及氨基酸等。這些營養成分和生物活性成分的存在賦予了酵素多種生理功能，如抗氧化作用、抑菌作用、保護心血管作用、緩解肥胖等。隨著人們對功能性食品的需求與日俱增，酵素產品逐漸受到消費者和學者的廣泛關注。

代謝組學是指對一個生物體系在特定的時間和條件下所有小分子代謝物質的定性定量分析，從而描述生物內源性代謝物的整體及其對內、外因素變化應答規律。非靶向代謝組學可以無偏向性地對所有小分子代謝物同時進行檢測分析，篩選出靶標的代謝物。目前代謝組學已被運用到食品研究中。胡明珍等利用非靶向代謝組學分析了副干酪乳酸桿菌發酵枸杞汁各階段的代謝差異，結果發現不同的發酵階段對枸杞發酵液中氨基酸類物質的代謝影響最大。唐富豪等利用非靶向代謝組學首次較系統評價了芥菜及其乳酸菌發酵芥菜的酚類物質組成和差異。

目前對酵素的研究主要集中在抗氧化方面，如金哲寧等對沙棘酵素功能成分及其體外抗氧化性能進行了研究，王高堅等對藍莓酵素發酵過程中的抗氧化活性進行了研究。姚笛等對火龍果、藍莓、桑葚三種酵素的抗氧化活性與微生物多樣性的相關性進行了研究。酵素的功能成分復雜，影響抗氧化活性的因素眾多，而且難以運用某一特定的方法把所有的功能物質全部檢測出來，因此為酵素的功能性成分及其作用的研究造成了較大困難。代謝組學可以宏觀的檢測出樣品間的主要差異物質，運用代謝組學技術分析不同酵素產品間的差異代謝物的研究未見報道。

本研究以新鮮的藍莓和沙棘為原料，采用自然發酵的方法制得藍莓酵素和沙棘酵素，使用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜測定藍莓和沙棘酵素中全部代謝物質的豐度，結合多元統計分析方法篩選差異代謝物，分析相關的代謝通路，找出藍莓和沙棘酵素之間的主要代謝差異，為水果酵素中特征性功能性成分的研究提供有效地研究策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藍莓和新鮮沙棘 均購買于當地農貿市場；單晶冰糖 購買于安徽福香源生態農業科技有限公司；甲醇（色譜級）、乙腈（質譜級）、2-氯苯丙氨酸（純度98.5%）、甲酸（質譜級）、甲酸銨（純度99.9%）國藥集團；去離子水 通過Millipore 系統制得。

H1850-R 冷凍離心機 湖南湘儀公司；QL-866混勻儀 德國Vortex Mixer 公司；5305 真空濃縮儀 德國Eppendorf 公司；UltiMate 3000 液相色譜儀、Q Exactive 質譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵素的制備 用無菌水在無菌條件下分別輕輕沖洗藍莓和沙棘，除去表面沙子和灰塵，在無菌操作臺中自然晾干。冰糖用紫外殺菌，酵素罐（2 L）用高壓蒸汽滅菌。將發酵水果原料與冰糖按質量比1:1，分別加入已滅菌的酵素罐中，一層原料一層冰糖，食材壓實，排盡空氣，裝至酵素罐2/3 處，封口，放置暗處發酵一年。取每種水果發酵樣品各6 個平行，收集密封后于液氮中保存。

1.2.2 樣品制備及處理 在4 ℃下將所有樣本融化30 min，從每個樣本中各取100 μL 于2 mL 離心管中，向每個離心管加入400 μL 甲醇并振蕩60 s，使其充分混勻；在12000 r/min 4 ℃下離心10 min，將全部上清液轉移至新的2 mL 離心管中，真空濃縮干燥；用150 μL 2-氯苯丙氨酸（4 mg/L）80%甲醇溶液復溶，使用0.22 μm 膜過濾上清液，得到待測樣本，進行LC-MS 檢測。每個樣品均有6 個生物學重復。

1.2.3 儀器檢測條件 超高效液相色譜條件：采用Thermo Ultimate 3000 儀器進行色譜分離，使用ACQUITY UPLCHSS T3 1.8 μm（2.1 mm×150 mm）色譜柱，將自動進樣器溫度設為8 ℃，流速為0.25 mL/min，色譜柱溫度維持在40 ℃，進樣2 μL 進行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負離子5 mmol/L 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序為0～1 min，2%流動相B/D；1～9 min，2%～50% 流動相B/D；9～12 min，50%～98%流動相B/D；12～13.5 min，98%流動相B/D；13.5～14 min，98%～2%B/D；14～20 min，2% D-正模式（14～17 min，2% B-負模式）。

飛行時間質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度設置為325 ℃，以分辨率70000 進行全掃描，掃描范圍為81～1000 u，利用HCD 對其進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時利用動態排除除去沒不必要的MS/MS 信息。

1.3 數據處理

利用Proteowizard 軟件（v3.0.8789）對數據進行峰識別、過濾、對齊，對數據的峰面積進行歸一化。對于多元變量分析，采用主成分分析方法（principal components analysis，PCA），對數據進行質量控制（QC）與質量保證（QA）分析。使用和進行主成分分析（PCA）和最小二乘法判別分析PLS-DA（Partial Least Squares Discriminant Analysis），根據學生式t 檢驗的值＜0.05，同時PLS-DA 模型主成分的VIP 值＞1，進行差異性代謝物的篩選。采用基于KEGG 數據庫中的MetPA 數據庫分析差異代謝物的相關代謝通路。對差異顯著的代謝通路進行注釋并分析各差異代謝路徑之間的總關系圖。

2 結果與分析

2.1 兩種酵素樣品的代謝物主成分分析（PCA）

圖1 是藍莓酵素和沙棘酵素這兩種樣品的主成分分析圖。第一主成分（PC1）的貢獻率是48.9%，第二主成分（PC2）的貢獻率是8.4%，兩者總貢獻率是57.3%，從整體上能夠反映出兩種樣品之間的代謝差異。從第一主成分方向看，藍莓酵素在第一主成分負軸上，沙棘酵素在第一主成分正軸上，從第二主成分方向看，藍莓酵素除了一個偏離較大的樣本外，其他樣本基本在中心線附近，沙棘酵素樣本也分布在中心線附近，兩種樣品在PC1 表現出組間差異，在PC2表現出組內聚集，說明兩種酵素樣品的代謝物差異主要體現在第一主成分上。

圖1 藍莓酵素（A）和沙棘酵素（B）的PCA 得分圖Fig.1 PCA score chart for blueberry jiaosu (A) and seabuckthorn jiaosu (B)

2.2 兩種酵素樣品的PLS-DA 分析

PLS-DA 是偏最小二乘法-判別分析，是一種監督模型。PLS-DA 可以忽略組內誤差，消除與研究目的無關的隨機誤差，因此本文進一步采用PLS-DA方法對構建的模型進行驗證。兩種酵素樣品的PLSDA 得分圖如圖2（a）所示，藍莓酵素樣品主要分布在置信區間左側，沙棘酵素樣品主要分布在置信區間右側，說明該模型能夠對兩種酵素樣品進行有效區分。此外，模型的交叉驗證參數X=0.555，Y=1，=0.987，這三個模型參數均大于0.5，說明模型的可解釋度和可預測性良好，因此本研究建立的PLSDA 模型能夠有效解釋兩種酵素之間的代謝差異。

因為PLS-DA 在建模時對樣品進行了指定和分組，所以能更大地區分組間差異，但這也導致數據的PLS-DA 模型存在過擬合的問題，因此采用隨機置換檢驗法對模型進行外部交叉驗證，如圖2（b）所示，回歸線呈向上趨勢，圖中所有藍色的點從左到右均低于最右側的原始的藍色的點，說明置換檢驗過關，模型不存在過度擬合的現象，可用于探索兩種酵素樣品的代謝物差異。

圖2 兩種酵素樣品的PLS-DA 得分圖（a）和置換檢驗圖（b）Fig.2 PLS-DA score chart (a) and replacement test chart (b) for two jiaosu samples

2.3 差異代謝物組學分析

根據PLS-DA 模型分析結果，將t 檢驗的值小于0.05 的代謝物和樣本之間代謝物濃度的差異倍數FC 值大于1.5 或小于0.5 的代謝物作為篩選標準，來篩選藍莓和沙棘酵素之間差異顯著的代謝物。兩種酵素樣品中共得到3728 個差異代謝物，上調的差異代謝物有1151 個，下調的差異代謝物的有2577 個，由此可知，酵素中的代謝物組成非常豐富，用傳統方法無法對酵素中的代謝物質進行全部研究而且無法對主要代謝物進行篩選和鑒定。經篩選處理后，共篩選出390 種主要差異代謝物，主要體現在有機酸類、氨基酸類以及黃酮類。

2.4 差異代謝物富集通路分析

由藍莓和沙棘兩種酵素的差異代謝物數量可知，酵素的發酵是一個非常復雜的過程，因此需要進一步對其代謝通路進一步分析。通過KEGG 數據庫的比對，共檢測出61 條代謝通路，將其結果繪制成氣泡圖，如圖3 所示，圖中每一個氣泡表示一個KEGG Pathway 通路。氣泡的大小和橫坐標數值表示影響值，氣泡越大和橫坐標數值越大表示此通路越重要。氣泡顏色和縱坐標數值表示富集分析的值（取負對數，即-lg），顏色越深值越小，富集程度越顯著。由圖3 可知，黃酮和黃酮醇的生物合成處的氣泡最大，顏色最深，說明藍莓酵素和沙棘酵素之間差異最顯著的代謝物質是黃酮類化合物。

圖3 代謝通路影響因子圖Fig.3 Metabolic pathway influence factor graph

根據差異代謝物在不同條件下，表達出的代謝物質之間的變化，通過比較藍莓和沙棘酵素之間的KEGG 代謝途徑，主要有13 條代謝途徑，由圖4 所示。其中差異較為顯著的代謝路徑是：黃酮和黃酮醇生物合成、-丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、賴氨酸生物合成、泛酸和輔酶A 生物合成、苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環（TCA 循環）、酪氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝。但是結合差異代謝物數據分析發現，-丙氨酸代謝、賴氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環（TCA 循環）、乙醛酸和二羧酸代謝路徑中并沒有差異代謝物質的出現。因此對有差異代謝物出現的6 條代謝路徑進行具體分析，如圖5 所示。將藍莓酵素和沙棘酵素進行比較，發現在兩種酵素中某些物質的含量差異較為顯著，把其數值的差異表示為差異倍數。

圖4 藍莓和沙棘酵素主要KEGG 代謝差異路徑Fig.4 Main KEGG metabolic difference pathway of blueberryjiaosu and sea-buckthorn jiaosu

圖5A 是黃酮和黃酮醇生物合成路徑，在該途徑中藍莓酵素與沙棘酵素相比，藍莓酵素中山奈素，山奈酚、木犀草素都表達為上調，差異倍數分別為2.2911、3.4576、4.974。沙棘酵素中3-O-甲基槲皮素表達為下調，差異倍數為0.04135。由此路徑可知，藍莓酵素中富含山奈素、山奈酚和木犀草素，三者都具有抗癌、抗菌、抗炎、免疫增強等作用。沙棘酵素中富含3-O-甲基槲皮素，這種物質可抑制癌細胞增殖、轉移和誘導凋亡。山奈酚經酶的催化合成山奈素，在類黃酮3'-單加氧酶的作用下，山奈酚轉化為槲皮素，通過黃酮醇3-O-葡萄糖乙酰轉移酶，將槲皮素轉移成異槲皮苷，槲皮素通過酶催化反應為3-O-甲基槲皮素，山奈酚在經過類莫酮生物合成反應生成芹菜素，由芹菜素通過黃酮類化合物3'-單氧酶合成為木犀草素。

圖5B 是精氨酸和脯氨酸代謝路徑，在該途徑中，1-吡咯啉-5-碳酸鈣通過吡咯啉-5-羧酸還原酶與脯氨酸相互轉化，脯氨酸通過脯氨酰4-羥化酶轉化為4-羥脯氨酸，再經過酶的催化生成1-吡咯啉-3-羥基-5-羧酸鹽，4-羥基谷氨酸半醛和1-吡咯啉-3-羥基-5-羧酸鹽相互轉化，后者通過1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶生成L-赤型-4-羥基谷氨酸。N4-乙酰基-氨基丁醛通過乙醛脫氫酶（NAD）轉化為N4-乙酰氨基丁酸，在經酶的催化生成4-氨基丁酸，最后經酶多步催化生成精氨酸。

圖5C 是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝路徑，在該途徑中藍莓酵素與沙棘酵素相比，沙棘酵素中的L-天冬氨酸表達為下調，差異倍數為0.42899，結果說明，沙棘酵素中富含L-天冬氨酸，具有促進肝機能的作用。這個途徑是圍繞檸檬酸循環進行的，分為兩條路徑，一條路徑為L-天冬氨酸通過酶的催化氧化轉化為延胡索酸鹽和L-天冬酰胺；另一條為2-酮戊二酸經過谷氨酸合成酶（NADH）催化生成L-谷氨酸鹽，然后通過谷氨酸脫羧酶轉化為4-氨基丁酸脂（GABA），經4-氨基丁酸酯經-氨基丁酸轉氨酶作用，生成琥珀酸半醛，利用琥珀酸半醛脫氫酶生成琥珀酸，最后L-谷氨酸鹽通過1-苯丙胺-5-甲基苯丙胺脫氫酶轉化為L-1-吡咯啉-5-羧酸鹽。

圖5D 是泛酸和輔酶A 生物合成，在該路徑中藍莓酵素與沙棘酵素相比，沙棘酵素中L-纈氨酸表達為下調，差異倍數為0.31624，表明沙棘酵素中富含L-纈氨酸，可作為營養增補劑。L-纈氨酸經過酶的多步催化生成R-泛酸。然后，尿嘧啶通過二氫嘧啶脫氫酶（DADP）與5,6-二氫尿嘧啶相互轉化，5,6-二氫尿嘧啶通過二氫嘧啶酶轉化為N-氨甲酰--丙氨酸，N-氨甲酰--丙氨酸通過-脲基丙酸酶轉化為-丙氨酸。

圖5E 是酪氨酸代謝路徑，在該路徑中酪氨酸通過天冬氨酸轉氨酶、酪氨酸轉氨酶和組氨酸磷酸轉氨酶聯合作用，轉化成4-羥基-苯丙酮酸，再通過4-羥基苯甲酸酯二氧酶生成尿黑酸，經多種酶催化生成延胡索酸鹽，由琥珀酸和延胡索酸鹽共同進入檸檬酸循環。

圖5F 是谷胱甘肽代謝路徑，藍莓酵素與沙棘酵素相比，藍莓酵素中谷胱甘肽表達為上調，差異倍數為5.2098；沙棘酵素中抗壞血酸表達為下調，差異倍數為0.66454，表明藍莓酵素中富含谷胱甘肽，沙棘酵素中富含抗壞血酸，二者都具有抗氧化作用。谷胱甘肽在谷胱甘肽水解酶作用下，一條合成途徑為催化合成L-半胱氨酰甘氨酸，再由丙氨酸氨基轉移酶和氨肽酶的聯合作用下合成L-半胱氨酸，然后，由L-γ-谷氨酰半胱氨酸通過-谷氨酰環素轉移酶催化下生成L-半胱氨酸和通過谷胱甘肽合成酶生成谷胱甘肽，另一條合成途徑為催化合成L-γ-谷氨酸-L-氨基酸，通過-谷氨酰環素轉移酶作用生成5-羥脯氨酸，然后在5-氧丙烯酸酶（ATP-水解）催化下生成L-谷氨酸鹽。谷胱甘肽在色氨酸和酶的作用下生成谷胱甘肽亞精胺，由谷胱甘肽亞精胺在酶的催化下生成色氨硫酮，在色氨硫酮生成二硫色胺途中，抗壞血酸在L-焦化過氧化酶催化下生成脫氫抗壞血酸。

圖5 藍莓和沙棘酵素的主要差異代謝物途徑Fig.5 The main differences in metabolite pathways between blueberries and sea buckthorn enzymes

2.5 差異代謝物的分析

根據藍莓酵素和沙棘酵素的最為顯著的關鍵代謝通路，共篩選并鑒定出9 個關鍵代謝物，如表1 所示。芹菜素、山奈素、木犀草素、山奈酚、3-O-甲基槲皮素屬于黃酮類，山奈酚、山奈素、木犀草素這三種物質在藍莓酵素中前三種物質平均相對豐度均呈上升趨勢。沙棘酵素中3-O-甲基槲皮素平均相對豐度均呈上升趨勢。黃酮類物質不僅具有抗氧化性，還具有抗菌抗病毒抗腫瘤等功效。L-天冬酰胺、谷胱甘肽、L-纈氨酸均屬于氨基酸類，其中L-天冬酰胺和L-纈氨酸在沙棘酵素中平均相對豐度均呈上升趨勢，二者對治療肝臟疾病有重要意義。藍莓酵素中富含谷胱甘肽，不僅可以作為體內的自由基清除劑，還可以起到預防癌癥、動脈硬化和延緩衰老的作用。抗壞血酸屬于有機酸類，在沙棘酵素中平均相對豐度呈上升趨勢，可以起到增強免疫力、延長機體壽命等作用。

表1 藍莓酵素和沙棘酵素關鍵代謝差異物Table 1 Key metabolic differential substances between blueberries and sea buckthorn enzymes

3 結論

本研究基于非靶向代謝組學技術，研究了藍莓酵素和沙棘酵素的差異代謝物質，共鑒定分析出3728 個差異代謝物，但是通過對差異代謝物通路分析，篩選出6 條最為顯著的關鍵通路，其中包含9 個關鍵代謝物，即芹菜素、山奈素、山奈酚、木犀草素、3-O-甲基槲皮素、L-天冬酰胺、谷胱甘肽、L-纈氨酸、抗壞血酸，其中有5 種參與黃酮和黃酮醇生物合成，1 種參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，2 種參與谷胱甘肽代謝，1 種參與泛酸和輔酶A 生物合成。從中可以映射出在黃酮和黃酮醇生物合成中代謝差異物質最多，其中藍莓酵素中富含山奈酚、山奈素和木犀草素、谷胱甘肽，沙棘酵素中富含3-O-甲基槲皮素、L-天冬酰胺、L-纈氨酸、抗壞血酸。從藍莓和沙棘酵素的差異代謝物數量可知，水果酵素中的成分非常復雜，在評價酵素功能成分時，無法利用傳統的分析方法對代謝物質進行鑒定，本研究首次利用非靶向代謝組學系統地分析了兩種常見水果酵素的代謝差異，找出了最關鍵的代謝差異物，為后續更精準地評價酵素功能性提供了一定的理論參考。