不同鹽濃度東北農家醬揮發性風味物質的差異分析

劉東傲，解雙瑜, ，李 智，李天一，彭 媛，孫 波,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.蕪湖職業技術學院食品與生物工程學院，安徽蕪湖 241002）

東北農家醬是我國東北地區的一種傳統發酵食品，它是以大豆、食鹽與水為原料經過自然發酵形成的半固態調味品。由于其生產過程是在開放環境中進行的，因此原料與環境中的大量微生物菌群都會進入其中參與發酵過程。其中許多不同種類的有益微生物菌群利用自身增殖與代謝過程中所產生的豐富酶類經過一系列復雜的生理生化反應將大豆原料中的蛋白質、碳水化合物等大分子物質部分地進行生物降解分解成小分子的多肽、游離氨基酸、還原糖類等物質，同時也完成了酒精的發酵，有機酸、高級醇和酯的形成等發酵過程，從而形成農家醬的獨特風味。但是在這個發酵過程中也會有許多有害微生物菌群與有益微生物競爭營養物質并產生具有不良風味甚至有食品安全風險的代謝產物。因此在實際生產中通常采用添加一定濃度食鹽的方式來控制這些微生物菌群的增殖與代謝活動。然而當食鹽的添加量過低時，食鹽對有害微生物菌群不能起到有效的抑制作用，進而無法控制其不良風味代謝產物的生成。當食鹽添加量過高時，雖然能夠有效抑制有害微生物菌群的增殖與代謝活動，但同時也會在一定程度上抑制有益微生菌群增殖與代謝活動，不利于其產品風味的形成，同時也不符合現代人對于低鹽健康食品的追求。因此在東北農家醬的發酵過程中對食鹽的添加量精準控制是至關重要的。

氣相色譜-質譜（GC-MS）分析是目前在食品揮發性成分的定性與定量分析中應用最廣泛的分析手段之一。其在食品中可用于產品質量控制、加工產品成分鑒定、樣品差異性分析等方面，在發酵豆制品中也有非常廣泛的應用。電子鼻是一種模擬人體生理嗅覺的智能感官分析設備，在各種食品的氣味評價中均有廣泛的應用。與GCMS 相比，電子鼻的操作更加簡便，數據結果穩定，但電子鼻無法對揮發性風味物質的具體成分進行分析。而近年來，氣相色譜-質譜結合電子鼻技術對食品的風味進行研究已成為一個熱門課題，其中也包括在部分豆醬類產品中的應用。然而目前聯用技術在豆醬類產品揮發性風味物質研究中的應用仍然較少，一般都采用單一儀器分析的方式，且研究內容大多圍繞發酵過程中風味的監控與不同產品之間的差異分析。鮮少有圍繞鹽濃度對豆醬類產品揮發性風味物質影響的研究。

基于此，本文通過HS-SPME-GC-MS 對不同鹽濃度東北農家醬發酵過程中揮發性風味物質進行檢測并結合電子鼻研究其風味特征變化；同時利用主成分分析（PCA）和聚類分析等多元統計手段對不同樣品之間的差異性進行分析。其目的是對食鹽在東北農家醬發酵過程中揮發性風味物質生成所產生的影響進行初步探究，為未來低鹽化東北農家醬工業生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 黑龍江農墾北安管理局紅星農場；鹽中鹽天津市長蘆鹽業有限公司；對甲氧基苯甲醛內標（純度≥98%）美國Sigma-Aldrich 公司。

XZG-3-A 旋轉蒸鍋 溫州市博泰機械科技有限公司；GC-2014AFSPL 氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；50/30 μm 固相微萃取三相頭（DVB/CAR/PDMS）上海安譜科學儀器有限公司；PEN3 型便攜式電子鼻 德國Airsense 公司；LG10-2.4A 高速離心機 北京醫用離心機廠；FA2004 分析天平 上海衡平儀器儀表廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 東北農家醬的生產工藝流程 大豆→除雜→浸泡→蒸豆→卡塊→制曲→曲塊入醬缸→加鹽水→發酵→打耙、曬醬→灌裝封袋→殺菌→成品。

操作要點：室溫下將除雜后的大豆在泡豆池中用自來水浸泡8～12 h 至充分膨脹無硬芯，送入旋轉蒸鍋中進行加壓蒸煮，蒸煮條件：壓力為0.15 MPa、時間為30 min。蒸煮結束后進行粉碎并使用模具卡塊制成30 cm×20 cm×10 cm、重約6 kg 的曲塊。再用牛皮紙包裹后置于溫度：18 ℃、濕度：60% RH 的曲室中約60 d 制成成熟醬曲。選擇9 個150 kg 的醬缸，在每個醬缸中加入30 kg 粉碎后的成熟醬曲與70 kg 水，然后分別按醬曲與水總量的8%（W/W）、10%、12%的比例加鹽，每個鹽濃度3 個醬缸。在25 ℃條件下進行自然發酵，每天上、下午各打耙一次，60 d 后發酵結束。上述發酵生產過程均在黑龍江農墾北安管理局紅星農場北大荒親民有機食品有限公司東北農家醬生產車間完成。

1.2.2 東北農家醬發酵過程中的樣品采集 發酵0、30、60 d 時在醬缸同一位置進行取樣，每次取樣量均為200 g。將上述所有樣品按表1 進行編號后在-18 ℃條件下密封保存并用于GC-MS 與電子鼻進行檢測分析。

表1 東北農家醬樣品編號Table 1 Sample number of Northeast farmhouse soybean paste

1.2.3 東北農家醬揮發性風味物質的收集與分析

1.2.3.1 頂空固相微萃取 分別取樣品5.0 g 加入20 mL 樣品瓶并加入1‰的對甲氧基苯甲醛內標溶液20 μL，將樣品瓶放入60 ℃的水浴中平衡10 min；將老化6 min 的50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）萃取針頭插入樣品瓶，將石英纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中，60 ℃恒溫水浴萃取30 min 后，插入GC-MS的進樣器于250 ℃條件下解析1 min，同時啟動儀器采集數據。

1.2.3.2 氣相色譜-質譜檢測 色譜條件：進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。采用程序升溫方式，由室溫升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃在此溫度下保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，不分流進樣。

質譜條件：MS 離子源在225 ℃全掃描，電離方式：EI，電子能量70 eV；掃描質量范圍：50～500 amu。

1.2.3.3 揮發性風味物質定性、定量方法及氣味活性值分析 揮發性風味物質的定性分析：利用計算機對采集到的質譜圖進行檢索，輔助人工解析圖譜，與NIST02.L 標準譜庫進行對照匹配。

揮發性風味物質的定量分析：根據內標物的濃度、樣品中各組分的峰面積與內標峰面積的比值，通過下列公式計算農家醬樣品中各組分的含量。

式中：C 為待測東北農家醬揮發性成分含量（μg/kg）；A為待測東北農家醬的峰面積（AU/min）；C為內標物的質量濃度（μg/μL）；A為內標的峰面積（AU/min）；V 為內標的加樣量（μL）；m 為樣品質量（kg）。

OAV 分析：采用OAV 評價各化合物對樣品總體風味的貢獻；OAV≧1 的組分為樣品的關鍵風味物質，0.1≦OAV＜1 的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用。風味閾值通過查閱文獻，按下式計算OAV 值：

式中：C 為揮發性化合物含量（μg/kg）；T 為該化合物的察覺閾值（μg/kg）。

1.2.4 東北農家醬電子鼻檢測

1.2.4.1 樣品前處理方法 稱取5 g 東北農家醬樣品于20 mL 電子鼻樣品瓶中，然后置于55 ℃下水浴加熱20 min，25 ℃下平衡10 min 后插入電子鼻探頭對東北農家醬樣品中揮發性風味物質進行采集，并由10 個金屬氧化電極對其進行數據采集和分析。

1.2.4.2 電子鼻檢測方法 表2 為PEN3 型便攜式電子鼻傳感器性能描述。測試條件：樣品測試時間75 s，采集周期1.0 s；載氣為高純空氣，流速150 mL/min，頂空注射體積500 μL，注射速度500 μL/s，注射總體積2.5 mL，平行測定3 次，清洗時間120 s，內部流量300 mL/min，樣品流量300 mL/min。電子鼻檢測器經校準后，將前處理好的樣品按順序放入電子鼻樣品托盤中進行分析。

表2 電子鼻傳感器性能描述Table 2 Electronic nose sensor performance description

1.3 數據處理

每個樣品試驗均獨立重復三次。單因素方差分析與顯著性分析采用SPSS 22（IBM,美國）進行（＜0.05）；主成分分析（principal components analysis,PCA）采用SIMCA-P+13 軟件（Umetrics，瑞典）進行并繪圖；聚類分析與相關性分析采用R version 4.1.2（Bird Hippie）及Origin 2021 進行并繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同鹽濃度東北農家醬樣品中揮發性風味物質分析

采用HS-SPME-GC-MS 聯用技術對發酵過程中不同鹽濃度東北農家醬進行揮發性風味物質檢測，共鑒定出揮發性化合物67 種，它們在不同鹽濃度東北農家醬樣品中的組成如圖1 所示。其中，酯類物質18 種，酸類物質14 種，醇類物質13 種，萜烯類物質5 種，酚類物質4 種，雜環類物質4 種，酮類物質4 種，醛類物質3 種，硫醚類物質2 種。而OAV≥0.1 的風味物質有20 種，其結果如表3 所示。

表3 不同鹽濃度東北農家醬樣品中揮發性風味物質的OAVTable 3 OAV of volatile flavor compounds in Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

圖1 不同鹽濃度東北農家醬樣品中揮發性風味物質組成Fig.1 The composition of volatile flavor compounds in Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

發酵0 d 時，OAV≥0.1 的揮發性風味物質只有兩種，且這兩種物質的OAV 值在8%、10%、12%鹽濃度樣品中無顯著性差異（＞0.05）。其中，三甲基吡嗪的OAV 值大于1，可以認為三甲基吡嗪是發酵0 d樣品中的重要揮發性風味物質。

發酵30 d 時，OAV≥0.1 的揮發性風味物質為12 種，其中，8%鹽濃度樣品中有12 種，10%和12%鹽濃度樣品中各有8 種。而這12 種揮發性風味物質中OAV＞1 的關鍵風味物質有9 種，包括苯乙醛、異戊酸乙酯、苯丙酸乙酯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、丁香酚、愈創木酚、吲哚和三甲基吡嗪。其中，三甲基吡嗪與發酵0 d 相比有顯著增加（＜0.05）。隨著鹽濃度的增加，除丁香酚和愈創木酚外其它每種關鍵風味物質的OAV 均顯著下降（＜0.05）。丁香酚只存在于8%鹽濃度樣品中，而愈創木酚只存在于12%鹽濃度樣品中。

發酵60 d 時，OAV≥0.1 的揮發性風味物質為20 種，其中，8%鹽濃度樣品中有19 種，10%鹽濃度樣品中有11 種，12%鹽濃度樣品中有10 種。而這20 種揮發性風味物質中OAV＞1 的關鍵風味物質有12 種，包括苯乙醛、辛酸乙酯、異戊酸乙酯、苯丙酸乙酯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、苯酚、愈創木酚、丁香酚、吲哚、2,5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪。其中，辛酸乙酯、苯酚與2,5-二甲基吡嗪為發酵60 d時首次出現的關鍵風味物質，而其它9 種關鍵風味物質與發酵30 d 相比均有顯著增加（＜0.05）。隨著鹽濃度的增加，除愈創木酚外其它每種關鍵風味物質的OAV 均有顯著下降（＜0.05）。雖然苯酚存在于8%、10%鹽濃度樣品中但只有在8%鹽濃度樣品中為關鍵風味物質。而愈創木酚只存在于12%鹽濃度樣品中。

由上述實驗數據可以看出，在同一鹽濃度條件下，隨著發酵時間的延長，樣品中風味物質的種類及OAV 值均呈現出了增加的趨勢。而在相同的發酵時間，隨著鹽濃度的增加樣品中風味物質的種類及OAV 值大部分呈現出下降的趨勢。發酵0 d 時樣品的風味物質主要來源于醬曲中蛋白酶分解蛋白質的過程，因此此時的風味物質種類較少并且與后續發酵過程中的風味物質存在一定差異。而在后續的發酵過程中，鹽濃度越高，其對微生物的抑制作用越強，樣品中參與發酵過程的微生物越少，因此，風味物質的種類和OAV 值與鹽濃度呈現出負相關的趨勢。

2.2 不同鹽濃度東北農家醬樣品電子鼻傳感器響應值結果

不同鹽濃度的東北農家醬樣品電子鼻傳感器響應值結果如圖2 所示。發酵0 d 時樣品的10 個傳感器響應值均低于10，其中，W1C、W3C、W5C、W2W傳感器的響應值相對較高。這表明在發酵0 d 時東北農家醬中可能存在著氨類、烷烴類和有機硫類等化合物。發酵30 d 與60 d 時樣品隨發酵時間的增加其W5S、W6S、W1S、W1W、W2S、W3S 傳感器響應值均有增加；而W1C、W3C、W5C、W2W 傳感器的響應值均有減少。這表明在整個發酵過程中可能有甲基類、醇類、醛酮類化合物等物質增加而氨類物質、短鏈烷烴與有機硫化物等物質減少。在發酵0 d 時，8%、10%、12%鹽濃度樣品之間傳感器響應值并無明顯差異，而在發酵30 d、60 d 時樣品隨鹽濃度的增加其W2W 傳感器的響應值增加，而W5S、W6S、W1S、W1W、W2S、W3S 傳感器響應值均有減少。這表明鹽濃度的增加會促進有機硫類化合物的產生，抑制烷烴類、醇類與氫化物類化合物的產生。

圖2 不同鹽濃度東北農家醬樣品電子鼻數據變化雷達圖Fig.2 Radar chart of electronic nose data of Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

2.3 不同鹽濃度東北農家醬樣品的主成分分析結果

不同鹽濃度東北農家醬樣品的主成分分析結果如圖3 所示。其中，a 為揮發性風味物質的PCA 結果，其PC1 為93.0%，PC2 為1.9%，前兩個主成分累計方差貢獻率為94.9%，可以代表揮發性風味物質的總體信息。b 為電子鼻的PCA 結果，其PC1 為80.4%，PC2 為8.7%，前兩個主成分累計方差貢獻率為89.1%，可以代表電子鼻數據的總體信息。

圖3 不同鹽濃度東北農家醬樣品的主成分分析圖Fig.3 PCA of Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

從兩個PCA 圖可以看出，發酵0 d 時樣品都集中橫坐標的左側，發酵30 d 與60 d 時樣品隨發酵時間的增加整體向橫坐標的右側移動。在發酵0 d時，8%、10%、12%鹽濃度樣品之間距離很近，說明發酵0 d 時不同鹽濃度樣品之間差異很小。而在發酵30 d 與60 d 的樣品中，隨著鹽濃度的增加樣品在橫坐標上逐漸從右向左移動，且不同鹽濃度樣品之間的距離逐漸增加。其中，8%鹽濃度樣品與10%、12%鹽濃度樣品之間距離較遠，而10%與12%鹽濃度樣品之間的距離較近，說明8%鹽濃度樣品與10%、12%鹽濃度樣品之間差異較大，10%與12%鹽濃度樣品之間的差異較小。這與前面HS-SPME-GCMS 的分析結果相一致。

2.4 不同鹽濃度東北農家醬樣品的熱圖與聚類分析

圖4 中a 為不同鹽濃度的東北農家醬樣品中OAV≥0.1 的揮發性風味物質的熱圖與聚類分析。9 組東北農家醬樣品可以分為3 類，其中，LS1、MS1、HS1、MS2、HS2 為一類；LS2、MS3、HS3 為一類；LS3 為一類。聚類分析結果表明，發酵0 d 時8%、10%、12%鹽濃度樣品之間相似度較高，而這3 個樣品與發酵30 d 時10%、12%鹽濃度樣品之間也存在一定的相似性，發酵30 d 8%鹽濃度樣品與發酵60 d 10%、12%鹽濃度樣品相似度也比較高，而發酵60 d 8%鹽濃度樣品與其他所有樣品都存在著一定差異。圖4 中b 為不同東北農家醬樣品電子鼻傳感器響應值的熱圖與聚類分析。圖中9 組東北農家醬樣品可以分為3 類，其中，LS1、MS1、HS1 為一類，LS2、MS2、HS2 為一類，LS3、MS3、HS3 為一類。聚類分析結果表明，相同發酵時間的樣品相似度較高。圖4中聚類分析的結果與PCA 的結果相似，這說明鹽濃度會對東北農家醬的風味產生顯著的影響。這是由于參與其發酵過程中不同微生物菌群對鹽濃度耐受性差異很大，隨著鹽濃度變化這些微生物菌群增殖及代謝產物生成也會相應發生變化所造成的。

圖4 不同鹽濃度東北農家醬樣品的熱圖與聚類分析Fig.4 Heat map and cluster analysis of Northeast farmhouse soybean paste samples with different salt concentrations

3 結論

本研究采用頂空固相微萃氣相色譜-質譜聯用技術（HS-SPME-GC-MS）與電子鼻技術對不同鹽濃度（8%、10%、12%）東北農家醬發酵過程中（0、30、60 d）揮發性風味物質的變化與風味特征進行檢測并通過PCA 與聚類分析對樣品間的差異性進行統計分析。結果表明鹽濃度會對東北農家醬發酵過程中的揮發性風味成分的生成產生顯著影響，當鹽濃度越低時其風味成分種類及含量就越豐富。該實驗結果不僅有利于提升產品質量與風味，而且也為開發低鹽化產品提供理論支持。應該注意的是鹽濃度對東北農家醬中微生物菌群多樣性及其代謝機制的影響目前尚不明確。所以未來仍然需要在確保東北農家醬食品安全的前提下減少食鹽添加量，在促進揮發性風味物質生成方面進行更深入研究。