利于高地芽孢桿菌YC-9生長和芽孢形成的碳源篩選

馬聰聰， 羅澤華， 蔡斌， 劉好寶*， 王云山， 馬銳， 顧金剛*

（1.中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，海口 570105；2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；3.中國科學院過程工程研究所，北京 100190）

高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)多分布于土壤，產淀粉酶和堿性蛋白酶[1]。在生長發育后期，芽孢桿菌的細胞質高度脫水可形成圓形或橢圓形的休眠體，即芽孢[2]。芽孢具有耐高溫、耐高壓、耐干燥、耐酸堿、耐有機溶劑等特性，廣泛應用于醫藥、種植業、畜牧業等領域[3-4]。產芽孢不穩定、芽孢率低、芽孢量少等會影響芽孢桿菌的應用[5]。碳氮源是影響芽孢桿菌形成芽孢的重要因子[6]。芽孢的研究主要集中于芽孢的形成機制和營養因素促進芽孢產生的影響等方面[5-6]，其中，芽孢桿菌芽孢產生的優化主要有碳氮源、無機鹽等營養因子以及接種量等培養條件的優化，且都集中在搖瓶水平，優化方法較單一、傳統。本研究采用Biolog PM 表型分析系統和全自動生長曲線儀，實現菌株發酵的高通量和自動化，利用Biolog 系統GenⅢ鑒定板的碳源底物和全自動生長曲線空白板配制不同碳源培養基，實現對碳源的快速篩選和產芽孢能力的測定，并利用2 種設備的專業軟件對數據進行處理和分析。利用這2 種儀器研究高地芽孢桿菌YC-9 在不同碳源條件下的產芽孢量和生長周期，以獲得提高YC-9 的產芽孢量和產芽孢率的最佳碳源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養基

供試菌株：高地芽孢桿菌菌株Bacillus altitudinisYC-9，由中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所農業農村部農業微生物資源收集保藏重點實驗室分離鑒定。

LB 培養基(1L)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

液體培養基(1L)：碳源 5.0 g，(NH4)2SO43.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0，1×105Pa 滅菌30 min。

碳源篩選培養基(1L)：利于菌體生長的碳源5.0 g，利于產孢的碳源5.0 g，(NH4)2SO43.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

發酵培養基 (1L)：碳源5.0 g，蛋白胨3.0 g，酵母浸粉 3.0 g，葡萄糖 1.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0～7.2，1×105Pa滅菌30 min。

1.2 Biolog PM 表型鑒定

菌株YC-9 經LB 培養基活化后，用無菌棉簽蘸取少量菌體接種于Biolog GenⅢ接種液中，用濁度計將接種液細胞含量調節為98%T（T表示菌懸液濁度），制成孢子懸浮液備用。將100 μL 制備好的孢子懸浮液分別加入GenⅢ的微孔后放入OmniLog 培養箱中，37 ℃條件下分別培養12、24、36 h[7]。以Biolog 軟件完成數據的格式轉換與處理，以熒光動力曲線下的高度(height)為參數進行數據分析，選3 次試驗的平均高度進行計算。培養結束后收集2 μL 培養液，涂片風干，番紅染色，鏡檢觀察載玻片確定芽孢數量[8]。每處理設置3個重復。

1.3 單一碳源篩選

以無菌水培養基為對照，將Biolog PM 確定的最適碳源分別作為液體培養基的碳源，用全自動生長曲線儀監測菌株YC-9的生長曲線。用無菌牙簽將菌株 YC-9 接種于 LB 培養液，37 ℃、200 r·min-1培養12 h后制成接種液。接種液和液體培養基以1∶7的比例混勻，在生長曲線儀100孔培養板中，每個孔加入接種液300 μL，放入全自動生長曲線儀中，每種碳源設置3個重復，即培養板上的3個孔，37 ℃、200 r·min-1培養48 h，測定芽孢量。

1.4 碳源組合篩選

以利于菌體生長的碳源和利于產芽孢的碳源進行組合制備碳源篩選培養基，進一步篩選碳源。種子液制備同1.3。種子液以5%的比例接種于裝液量為50 mL 的錐形瓶中（容積250 mL），37 ℃、200 r·min-1培養。每 4 h 測定 1 次 pH 和 OD600值；48 h 時結束發酵，采用平板菌落計數法檢測細菌總數；80 ℃水浴加熱10 min 處理發酵液，稀釋涂布平板法檢測芽孢量[9]。每種碳源組合設置3個重復。

1.5 搖瓶條件下碳源篩選

在搖瓶條件下，分析不同碳源及碳源添加對菌株YC-9 生長和產孢的影響。以常見碳源葡萄糖為對照組，葡萄糖+篩選碳源為試驗組制備發酵培養基，種子液以5%的比例接種至含50 mL組合培養基的錐形瓶中（容積250 mL），培養方法及菌體數、芽孢數、pH和OD600值檢測同1.4。

1.6 數據處理

采用Biolog D5E_OKA_data.exe 軟件收集各菌株的代謝表型數據并進行格式轉換，使用Biolog OL_FM_1.2.exe 軟件進行數據分析，選3 次試驗平均峰高度進行計算。分別采用GraphPad Prism 8和Origin 9做曲線圖和柱形圖。

2 結果與分析

2.1 Biolog碳源利用情況和產芽孢分析

GenⅢ板含有71 種供試碳源，菌株YC-9 利用各種碳源生長和產孢的情況如表1 所示。利于菌株YC-9 生長和產孢的碳源有4 種，分別為肌醇、果膠、D-果糖-6-磷酸和半乳糖醛酸。產芽孢較多但生長較差的碳源有14種，其中糖類居多，其次是酸類，包括D-松二糖、水蘇糖、D-棉子糖、D-乳糖、蜜二糖、N-乙酰神經氨酸、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨醇、α-羥基丁酸、β-羥基-D,L-丁酸、L-丙氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸。產芽孢量低但利于生長的碳源有16種，包括D-海藻糖、D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、水楊苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油、D-天冬氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、奎寧酸、L-蘋果酸、γ-氨基丁酸和乙酰乙酸。

表1 高地芽孢桿菌菌株YC-9利用GenⅢ板上不同碳源的生長和產孢情況Table 1 Growth and spore yields of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources on GenⅢplate

表1 高地芽孢桿菌菌株YC-9利用GenⅢ板上不同碳源的生長和產孢情況Table 1 Growth and spore yields of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources on GenⅢplate 續表Continued

以下選擇8 種生產上較為常用、產芽孢量低但利于生長的碳源進行后續研究，分別為D-海藻糖、D-纖維二糖、水楊苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油、L-蘋果酸。

2.2 不同碳源和碳源組合對菌株YC-9 生長的影響

基于Biolog PM 營養表型分析結果，采用全自動生長儀分析8種單一碳源培養條件下菌株YC-9的生長狀況和產孢能力。綜合圖1 和表2 結果分析，該菌以水楊苷為底物時可以快速生長，培養16 h 的生物量高于其他碳源，但芽孢率在24、36、48 h 時相比于其他碳源都較低；α-D-葡萄糖為底物時，菌體生長呈先上升后下降的趨勢，培養16 h時菌體密度最大，在36和48 h 時芽孢率較高。以L-蘋果酸為底物時，培養24 h 時菌體密度最大，24～32 h 處于平穩階段，36 和 48 h 時芽孢率為93%。結合Biolog PM 表型分析結果，水楊苷為芽孢產量低、菌體生長好的最佳碳源。

表2 菌株YC-9在各碳源中的芽孢率Table 2 Spore rate of strain YC-9 by using different carbon sources

圖1 高地芽孢桿菌菌株YC-9在不同碳源條件下的生長曲線Fig.1 Growth curves of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources

基于Biolog PM 表型分析結果和單一碳源篩選結果，選擇7 種芽孢產量高但菌體生長差的碳源與水楊苷組合培養菌株YC-9。以單一碳源水楊苷為對照，菌株YC-9 水楊苷分別與L-鼠李糖、D-山梨醇和D-棉子糖為組合的生長曲線基本一致，細胞量上升較緩慢，培養16 h 達最大菌密度（OD600約為0.46），之后呈平穩趨勢；其他3種碳源組合（對照水楊苷、水楊苷+肌醇及水楊苷+半乳糖醛酸組合）上升較快，最大OD600值約在0.8～1.0；其中水楊苷+水蘇糖組合在24 h 后呈緩慢下降趨勢，48 h時OD600值下降至0.7左右（圖2）。

以葡萄糖替代水楊苷，分別與D-山梨醇和肌苷組合成雙碳源。與單一碳源葡萄糖相比，菌株YC-9 的生長曲線變化趨勢大致相同，其中葡萄糖+D-山梨醇的碳源組合相對不利于菌體生長，而葡萄糖+肌苷的碳源組合最利于菌體生長，培養12 h達最大菌密度（圖2）。

圖2 菌株YC-9在不同各碳源組合條件下的生長曲線Fig.2 Growth curves of Bacillus altitudinis YC-9 using different dual carbon sources

2.3 不同碳源組合對菌株YC-9 發酵液pH 的影響

在搖瓶水平上監測不同碳源組合培養下菌株YC-9 發酵液的pH 變化，以水楊苷與其他碳源組合培養菌株YC-9時，其發酵液pH 都呈下降趨勢；其中水楊苷+肌醇的組合碳源的發酵液pH 下降更快，12 h 時低至pH 5.3左右（圖3）。

以常見的工業發酵碳源葡萄糖替代水楊苷時，菌株YC-9 的發酵液pH 變化趨勢呈先下降再上升，pH 由中性變到堿性，高于9.0。其中葡萄糖+D-山梨醇組合的發酵液pH 較其他2個組合高，而葡萄糖+肌苷組合的發酵液pH 相對偏小（圖3）。

圖3 不同碳源組合下菌株YC-9發酵pH Fig.3 Fermentation pH of strain YC-9 under different carbon source combinations

2.4 不同碳源對菌株YC-9生長和產孢的影響

在全自動生長曲線儀上研究不同單一碳源培養下菌株YC-9發酵液的產芽孢量變化（表2）。菌株YC-9在24 h時以D-海藻糖和甘油為碳源時，芽孢率差異不顯著，但和其他碳源相比芽孢率顯著提高；在36和48 h時以α-D-葡萄糖和L-蘋果酸為碳源時差異不明顯，但產芽孢率和其他碳源相比顯著提高，以L-蘋果酸為碳源時芽孢率均高達93%。結果表明，菌株YC-9在培養36和48 h以α-D-葡萄糖和L-蘋果酸為碳源可明顯提高芽孢率。

同時在搖瓶水平上監測不同組合碳源培養下菌株YC-9的48 h內的生長和產孢情況（圖4）。菌株YC-9 在所有的待測培養基中的生長和產孢趨勢一致，培養12 h 時菌體數較高，在12 和24 h 時芽孢數較高。在菌體生長方面，以水楊苷+水蘇糖和水楊苷+L-鼠李糖組合為碳源時，菌株YC-9的菌體數在4個時間點和只添加水楊苷的對照組菌體數相比均差異顯著（P＜0.05）；在產芽孢方面，水楊苷+肌醇的組合碳源和對照組差異不大，水楊苷+D-棉子糖和水楊苷+L-鼠李糖的組合碳源與對照相比芽孢數有顯著差異，但芽孢率不高；水楊苷+肌苷和水楊苷+D-山梨醇的組合碳源與對照相比芽孢數顯著提高，培養24 h 時芽孢率分別為35.67%和23.94%。結果表明，高地芽孢桿菌YC-9 在搖瓶水平上的產孢結果與Biolog PM 表型分析結果一致；水楊苷基礎上添加D-棉子糖、L-鼠李糖、肌苷和D-山梨醇與對照相比芽孢數差異顯著，其中添加肌苷和D-山梨醇芽孢率相對較高。

圖4 不同碳源組合下菌株YC-9生長和產孢情況Fig.4 The growth and sporulation of Bacillus altitudinis YC-9 under different carbon sources

同時在搖瓶水平上監測以葡萄糖替代水楊苷與肌苷或D-山梨醇組合培養菌株YC-9 的生長和產孢情況（圖5）。在菌體生長方面，該菌株在葡萄糖+肌苷的組合碳源與只添加葡萄糖的對照相比菌體數顯著提高（48 h 時除外），在12 h 時菌體數高達 3.00×108cfu·mL-1；在產芽孢方面，葡萄糖+D-山梨醇的碳源組合在12和36 h與對照組相比芽孢數顯著提高，36 h 時芽孢率達56.64%。葡萄糖+肌苷在24 和48 h 與對照組相比顯著提高，24 h 芽孢總量為 3.90×107cfu·mL-1，芽孢率高達60.47%，其他時間點變化不大。結果表明，菌株YC-9以葡萄糖+肌苷為碳源時，芽孢數增長顯著，且芽孢率是僅以葡萄糖為碳源時的2 倍，并且菌株YC-9 的最佳生長時期為12 h，最佳產芽孢時間為24～36 h。

圖5 不同碳源組合下菌株YC-9生長和產孢情況Fig.5 Growth and sporulation of Bacillus altitudinis YC-9 under different carbon sources

3 討論

芽孢是芽孢桿菌在一定培養條件或生長階段下形成的抗逆性很強的休眠體[10]，受碳氮源、溫度、pH 等影響[11-12]，其中在芽孢形成過程中，碳源是影響芽孢形成的主要因素[13]。徐世榮等[5]研究發現，通過營養限量可誘導B.subtilis芽孢的形成，根據不同微生物的需要，選擇適宜的碳源，才能實現菌體或芽孢數量的提高。本研究表明，高地芽孢桿菌菌株YC-9對碳源的代謝能力較好，以水楊苷為碳源時產芽孢率較低，以L-蘋果酸和α-D-葡萄糖為碳源時產孢率顯著提高。水楊苷對菌株YC-9 產芽孢可能有一定的抑制作用，但對菌體生長有促進效果。α-葡萄糖不僅有利于菌株YC-9菌體生長，也有利于產孢。菌株YC-9 以水楊苷+肌苷和水楊苷+D-山梨醇為組合碳源培養時不利于菌體生長，但顯著提高芽孢產生。Osadchaya等[14]研究表明，通過增加產孢培養基的碳源組成，B.subtilis的細胞生物和芽孢產量較單一碳源時有了顯著提高；當葡萄糖和木糖組成為1∶1 時，芽孢產量是葡萄糖和木糖為單一碳源時的1.43～1.90倍。本研究以葡萄糖替代水楊苷后，菌株YC-9在葡萄糖+肌苷的碳源組合中產芽孢數較單一葡萄糖提高，且產芽孢率高。

不同的碳源與菌株YC-9的發酵液pH 息息相關。當培養基以葡萄糖為碳源時，發酵液pH在后期都呈弱堿性，此時產芽孢率較高。Khardziani等[15]研究枯草芽孢桿菌KATMIRA 1933 時也發現，培養基的pH接近中性有利于芽孢桿菌的生長和營養細胞的最大積累，酸化會抑制芽孢桿菌的生長和產孢，而微堿性有利于產孢。本研究確定了高地芽孢桿菌菌株YC-9 的最佳生長和產孢碳源及發酵時間，初步揭示了高產孢的營養機制，為該菌株的工業生產發酵提供了重要的參數。