乳腺癌微環境中浸潤中性粒細胞與淋巴細胞的比值對預后的意義

程嵐卿，汪樹靜，盛有璟，江冬瑞，吳 強,

乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因之一[1]。盡管其治療水平不斷改善，但仍有約20%的患者出現腫瘤復發和轉移[2]，至今無可靠預后指標。因此，尋求特異性、可靠性、易獲得性的乳腺癌預后指標尤為重要。外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值(peripheral neutrophil-to-lymphocyte ratio, pNLR)與多種惡性腫瘤的不良預后密切相關[3]。但其數值極易受炎癥、神經內分泌壓力等非腫瘤因素的影響[4]，因此，將pNLR作為預測乳腺癌患者預后的指標尚存在缺陷和爭議。

宿主抗腫瘤免疫反應主要是由局部免疫細胞驅動，腫瘤原位浸潤的免疫細胞含量相對穩定。本實驗對乳腺癌組織中CD66b+腫瘤浸潤中性粒細胞(tumor infiltrating neutrophils, TINs)和CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)進行觀察，分析兩者及其比值(tumor infiltrating neutrophil-to-lymphocyte ratio, iNLR)在乳腺癌中的預后價值及臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2018年安徽醫科大學第二附屬醫院存檔的改良根治術切除并經病理檢查確診為非特殊型浸潤性乳腺癌組織112例，患者均為女性，年齡29～69歲，中位年齡50歲。所有患者術前均未行新輔助化療且診斷標準依照WHO(2019)乳腺腫瘤指南及第八版AJCC TNM分期。通過電話及查閱診療記錄進行隨訪，將手術時間作為隨訪起始時間，隨訪截至2021年1月。無進展生存期(progression-free survival, PFS)定義為手術至患者出現復發、轉移或隨訪截止時間。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(G10F5，BD Pharmingen公司，濃度0.5 mg/mL，稀釋比1 ∶75)；即用型兔抗人CD8單克隆抗體(SP16，福州邁新公司)；雙染檢測試劑盒(DS-003，抗小鼠IgG/HRP+抗兔IgG/AP)及GVA封片劑均購自北京中杉金橋公司。

1.3 雙重免疫組化所有標本均經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，4 μm厚連續切片，行免疫組化染色。免疫組化采用EnVison兩步法雙重染色，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。簡要步驟為切片脫蠟至水，抗原修復后滴加過氧化物酶阻斷劑，混合一抗4 ℃孵育過夜，混合二抗室溫孵育30 min，DAB及Fast-Red分別進行顯色，蘇木精復染，快速脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1.4 結果判讀CD66b陽性染色為細胞質和(或)細胞膜呈棕黃色[5]。CD8陽性染色為細胞膜呈玫紅色。分別計數10個高倍鏡視野乳腺癌癌巢中浸潤的CD66b+TINs和CD8+TILs，排除壞死組織、血管中染色陽性細胞及非特異性染色。以112例CD66b+TINs和CD8+TILs密度的中位數作為標準，將浸潤免疫細胞分為高密度組和低密度組。所有結果均由兩位病理科醫師獨立判讀。

1.5 統計學分析采用Graphpad(Prism 8.0)軟件進行統計學分析，χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行樣本率之間的比較，Kaplan-Meier檢驗進行生存分析，ROC曲線分析預測價值，Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌中CD66b+TINs和CD8+TILs浸潤情況在乳腺癌癌巢中可見CD66b+TINs和CD8+TILs浸潤，CD66b+TINs的浸潤密度為0～286個/10 HPF，中位密度為6個/10 HPF；CD8+TILs的浸潤密度為2～456個/10 HPF，中位密度為56個/10 HPF。計算得出，iNLR的數值為0～48.50，中位數為0.12(圖1)。

ABCD

2.2 CD66b+TINs密度、CD8+TILs密度和iNLR對乳腺癌患者PFS的預測價值分析Kaplan-Meier生存分析顯示，高密度CD66b+TINs和iNLR與患者PFS均呈負相關(P<0.05，圖2)，高密度CD8+TILs與患者PFS呈正相關(P<0.05，圖2)。ROC曲線分析結果顯示，CD66b+TINs、CD8+TILs及iNLR對乳腺癌患者PFS預測的ROC曲線下面積值分別為0.717、0.730和0.786(P<0.05，圖3)。

圖2 乳腺癌中CD66b+TINs密度、CD8+TILs密度及iNLR與患者預后的關系：A．CD66b+TINs密度與患者PFS的關系；B．CD8+TILs密度與患者PFS的關系；C．iNLR與患者PFS的關系

圖3 預測乳腺癌PFS的ROC曲線：A.CD66b+TINs密度的ROC曲線；B.CD8+TILs密度的ROC曲線；C.iNLR的ROC曲線

2.3 iNLR、CD66b+TINs密度、CD8+TILs密度與乳腺癌臨床病理特征的相關性iNLR與組織學分級、淋巴結轉移和Ki-67增殖指數呈正相關(P<0.05)，與ER、PR表達呈負相關(P<0.05，表1)。CD66b+TINs密度與組織學分級呈正相關(P<0.05，表1)。CD8+TILs密度與淋巴結轉移、組織學分級呈負相關(P<0.05，表1)。

表1 乳腺癌中iNLR、CD66b+TINs密度及CD8+TILs密度與臨床病理特征的關系

2.4 生存分析Cox單因素分析發現，高iNLR和低密度CD8+TILs與乳腺癌患者PFS相關(P<0.05，表2)。將單因素分析有關指標納入多因素分析，結果顯示，iNLR是影響乳腺癌患者PFS的獨立危險因素(HR=2.446，P<0.05，表2)。

表2 乳腺癌患者PFS的Cox單因素和多因素分析

2.5 CD66b+TINs密度和iNLR與乳腺癌分子分型的相關性乳腺癌的四種分子分型中，iNLR占比差異有統計學意義，三陰型乳腺癌(78.3%)中高iNLR病例明顯多于非三陰型乳腺癌(42.7%)(P<0.05，表3)。CD66b+TINs密度與乳腺癌分子分型無明顯相關性(P>0.05，表3)。

表3 iNLR和CD66b+TINs密度與乳腺癌分子分型之間的相關性

3 討論

腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)由腫瘤細胞、基質細胞和免疫細胞組成，近年來在癌癥進展中的作用逐漸受到重視。乳腺癌TME中存在豐富的免疫細胞，它們是腫瘤進展和免疫治療反應的關鍵參與者[6-7]。中性粒細胞和淋巴細胞是血液循環白細胞的主要成分和TME中免疫細胞的主要來源，在機體全身免疫反應中起關鍵作用，影響腫瘤的進展[8-9]。研究報道兩者的比值可以預測患者的預后，但多集中于外周血中的免疫細胞比值，即pNLR。pNLR是代表腫瘤炎癥反應的指標，在一定程度上可代表腫瘤負荷[10]，Guo等[11]分析了pNLR對乳腺癌患者的預后意義，發現pNLR是乳腺癌總生存率的預測指標。而另一項研究發現老年乳腺癌患者中的pNLR與總生存期和PFS無相關性[12]。這些研究提示pNLR對乳腺癌的預后價值尚存在爭議。

免疫細胞對腫瘤進展的影響主要在腫瘤微環境中實現，即浸潤腫瘤組織內的免疫細胞。TME中的各種免疫細胞發揮的作用不同，且相互作用過程復雜，因此，探索腫瘤組織中的iNLR可以更直接的反應局部腫瘤細胞與免疫細胞的相互作用。Ilie等[13]評估了非小細胞肺癌的iNLR對預后影響，發現其是高復發率和低生存率的獨立預后因素。另一項研究發現，iNLR升高與肝細胞癌切除術后無瘤生存期和總生存期降低顯著相關[14]。但乳腺癌iNLR對預后的影響尚未見報道。本實驗利用雙重免疫組化法檢測乳腺癌組織中浸潤的CD66b+TINs、CD8+TILs，分析了iNLR的預后價值。結果顯示，iNLR與乳腺癌患者的PFS呈負相關，ROC曲線顯示iNLR預測預后的準確性為0.786，進一步分析發現，iNLR與組織學分級、淋巴結轉移和Ki-67增殖指數呈正相關，Cox分析發現iNLR是乳腺癌PFS的獨立預后因子。

本實驗分析了CD66b+TINs和CD8+TILs與乳腺癌患者預后的相關性。越來越多的證據表明，中性粒細胞在癌癥的反應中起著重要的作用。在胃癌中，中性粒細胞激活并表達PD-L1，與胃癌預后呈負相關[15]。在小鼠乳腺癌模型中，CD66b+TINs及M2型巨噬細胞的浸潤促進乳腺癌細胞基質金屬蛋白酶9高表達[16]，可加速腫瘤的惡性進程[17]。本實驗結果表明，高密度CD66b+TINs與乳腺癌PFS呈負相關，與組織學分級呈正相關。CD8+TILs是抗腫瘤免疫效應機制之一，具有殺傷腫瘤細胞和細胞內病原體等細胞毒性能力，在誘導機體抗腫瘤反應中發揮重要作用[18]。Mahmoud等[19]分析1 334例乳腺癌中CD8+TILs的臨床意義，發現CD8+TILs與總生存期呈正相關。與之前研究結果一致，我們發現CD8+TILs密度較低的患者，預后較差。隨后，本實驗通過ROC曲線分析發現，iNLR的曲線下面積值為0.786，而CD66b+TINs和CD8+TILs的曲線下面積值分別為0.717和0.730，表明iNLR預測乳腺癌預后的準確性更高，能夠更好的預測乳腺癌患者預后并指導臨床治療。

國際免疫腫瘤生物標志物工作組的研究發現，浸潤到腫瘤實質的免疫細胞在HE染色觀察中易被忽略[20]。與免疫組化單染相比，免疫組化雙染對觀察兩種類型蛋白質的表達更具有優勢并且可廣泛應用于臨床研究，表明使用免疫組化雙重染色評估iNLR預測乳腺癌進展可以更容易地應用于臨床實踐。

綜上所述，iNLR是影響乳腺癌患者PFS的獨立危險因素，其預測乳腺癌預后的準確性優于單獨計數CD66b+TINs或CD8+TILs。iNLR是一種新穎的、可靠的臨床應用指標，可作為臨床評估乳腺癌患者預后的潛在預測指標。