腫瘤浸潤淋巴細胞聯合殘余腫瘤負荷在乳腺癌新輔助化療中的預后價值及意義

鐘燕燕，王進京，鐘戀君，羅 帥，鄭 洪

乳腺癌作為全球癌癥死亡的第二大因素，其病死率占所有癌癥死亡原因的11.6%[1]。殘余腫瘤負荷(residual cancer burden, RCB)指數考慮了殘留腫瘤床、殘余腫瘤細胞比例和淋巴結轉移等多種情況，可對乳腺癌患者術后進行殘余疾病評估[2]。鑒于新輔助化療后仍有較多乳腺癌患者不能達到病理完全緩解(pathological complete response, PCR)(PCR指乳腺癌原發灶及腋窩淋巴結手術標本病理檢查均未見浸潤性腫瘤細胞殘余)，采用RCB系統分層評估成為病理精準診斷的重要內容[3]。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)介導的適應性免疫反應是有效且持續的抗腫瘤反應的關鍵性基礎，腫瘤周圍微環境中的TILs也被認為在腫瘤免疫機制中起著免疫應答和調控作用[4-5]。RCB系統只考慮了殘余疾病情況，并未對宿主免疫應答情況進行考察，這有可能會對預后分析的準確性造成一定程度的偏差，而RCB與TILs的結合將會為我們帶來更多有效的預后信息。本實驗將RCB和TILs結合，定義為“RCB-TILs”指標，分析驗證該指標與乳腺癌臨床病理特征及預后的關系，為預測臨床療效提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2019年10月遵義醫科大學附屬醫院病理科存檔的空心針穿刺病理活檢診斷為浸潤性乳腺癌，并接受新輔助化療后行手術切除的乳腺癌患者106例，所有病例均經兩位以上有經驗的病理學專家確診。收集其臨床和病理資料，包括患者年齡、組織學特征、免疫表型、淋巴結轉移及存活時間等，存檔蠟塊組織健全。

1.2 乳腺癌分子分型根據ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫表型，將乳腺癌分為4個亞型：管腔A型(ER/PR陽性，且PR陽性率≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數<20%)、管腔B型(ER/PR陽性，HER2陰性，Ki-67增殖指數≥20%或PR陽性率<20%；ER/PR陽性，HER-2陽性及Ki-67增殖指數任何表達水平)、HER2過表達型(ER/PR陰性，HER-2陽性)和三陰型(ER、PR及HER-2均陰性)。本實驗將管腔A型和管腔B型歸為激素受體陽性乳腺癌(hormone receptor positive breast cancer, HRBC)。ER、PR、HER-2和Ki-67免疫組化結果判讀及分子分型參照最新對應指南進行[6-8]。

1.3 RCB的組織病理學評估RCB由MD Anderson腫瘤中心提出，根據原發腫瘤(原發腫瘤床面積、腫瘤細胞占瘤床百分比和原位癌百分比)和淋巴結轉移(陽性淋巴結數量和最大轉移直徑)的數據自動計算RCB[9]。RCB計算公式為：RCB=1.4(浸潤癌所占比例×原發灶腫瘤直徑)0.17+[4(1-0.75轉移淋巴結數目)×淋巴結轉移最大徑]0.17。根據計算結果將RCB分為三類：微小殘留疾病(RCB-Ⅰ)、中度殘留疾病(RCB-Ⅱ)或廣泛殘留疾病(RCB-Ⅲ)。由于RCB-Ⅰ被認為比RCB-Ⅱ和RCB-Ⅲ具有更好的預后，因此將RCB-Ⅰ歸為陽性，RBC-Ⅱ和RCB-Ⅲ歸為陰性。

1.4 TILs的組織病理學評估根據乳腺癌免疫腫瘤學生物標志物工作組的報告[10]，在術前經空心針穿刺病理標本的HE染色切片上評估腫瘤基質TILs。以所研究視野的比例表示，在400倍放大倍數下評估單核炎性細胞占腫瘤基質面積的百分比，原位癌和擠壓偽影等區域不包括在內。浸潤性腫瘤細胞巢周圍單核炎性細胞浸潤與基質面積比例分別按>50%、10%～50%和≤10%進行分類。>50%、10%～50%歸為TILs陽性，≤10%歸為陰性。

1.5 RCB-TILs評估RCB和TILs評估相結合，創建了“RCB-TILs”。RCB陽性且TILs陽性的患者被視為RCB-TILs陽性，任意RCB和(或)TILs陰性均被視為RCB-TILs陰性。

1.6 統計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，應用Pearson Chi-Square檢驗或Fisher精確檢驗進行分類變量相關性分析。采用Kaplan-Meier法評估無瘤生存期(disease free survival, DFS)，組間比較采用Log-rank檢驗。Cox比例風險模型進行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征乳腺癌新輔助化療前空心針穿刺及配對的新輔助化療后手術標本TILs的HE染色如圖1所示，合計106例，均為女性患者。其中HRBC 66例，HER-2過表達型乳腺癌(HER-2 positive breast cancer, HER2BC) 24例，三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)16例。平均年齡(47.3±9.4)歲(29～72歲)。在接受新輔助化療的患者中，34例(32.1%)為RCB-TILs陽性，72例(67.9%)為陰性。依據術后病理狀態將乳腺癌患者分為病理完全緩解(pathological complete response, PCR)組和非病理完全緩解(non-pathological complete response, non-PCR)組。其中18例(17.0%)為PCR，88例(83.0%)為non-PCR。

2.2 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌臨床病理特征的關系在新輔助化療后的乳腺癌組織中，RCB-TILs陽性與乳腺癌腫瘤直徑、淋巴結轉移、脈管侵犯及病理狀態具有相關性(P<0.05)。RCB-TILs陽性患者占腫瘤直徑<2 cm組及腫瘤直徑>2 cm組的比例分別為50%(16/32)和24.3%(18/74)，前組是后組的2.06倍，RCB-TILs陽性患者腫瘤直徑<2 cm可能性更大；RCB-TILs陽性患者占無淋巴結轉移組及有淋巴結轉移組的比例分別為52.5%(32/61)和4.4%(2/45)，前組是后組的11.9倍，RCB-TILs陽性患者更不易發生淋巴結轉移；RCB-TILs陽性患者占無脈管侵犯組及有脈管侵犯組比例分別為36.7%(33/90)和6.2%(1/16)，前組是后組的5.9倍，RCB-TILs陽性患者更不易發生脈管侵犯；RCB-TILs陽性患者占PCR組及non-PCR組的比例分別為72.2%(13/18)和23.9%(21/88)，前組是后組的3.02倍，RCB-TILs陽性患者更易獲得PCR。RCB-TILs陽性與患者年齡、Ki-67增殖指數及組織學分級無關(P>0.05，表1)。

ABC

表1 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌臨床病理特征的相關性[n(%)]

2.3 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌患者預后的關系隨訪106例患者，中位隨訪時間34個月(3～75個月)，其中85例患者存活且未發生病變復發、惡化、轉移等，21例無瘤生存。根據RCB-TILs狀態進行DFS分析，結果顯示新輔助化療后乳腺癌RCB-TILs陽性患者的DFS長于RCB-TILs陰性患者，差異有統計學意義(P=0.049 9，圖2)。

圖2 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌患者預后的關系

2.4 Cox單因素及多因素生存分析新輔助化療后乳腺癌患者預后相關因素Cox單因素分析顯示，患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移、脈管侵犯、分子分型、病理狀態、Ki-67增殖指數、RCB-TILs狀態、TILs強度均對患者DFS無明顯影響(P>0.05)；Cox多因素分析顯示，RCB-TILs陽性是經新輔助化療患者的有利因素，結果表明與RCB-TILs陰性相比，RCB-TILs陽性更有助于延長患者的DFS(HR=0.068，P=0.003，表2)。

表2 乳腺癌患者預后的Cox單因素和多因素生存分析

3 討論

乳腺癌的新輔助化療方法已被廣泛接受并應用，發現一個精準有效的指標預測新輔助化療預后對乳腺癌患者臨床后續診療評估至關重要。RCB可以準確識別出具有高復發風險的TNBC及HER2BC患者[11]。RCB分類越高，后續復發、轉移及擴散的可能性越大，可以為新輔助化療后non-PCR患者的復發風險做一系列的連續性預測，成為乳腺癌預后評估更加準確的方式[12-14]。

研究表明，乳腺癌組織中高TILs浸潤表現出更好的預后，并且還可以通過TILs的浸潤程度評估新輔助化療的治療效果[15]。經新輔助化療的原發性TNBC中治療前高TILs與PCR率的增加、更長的DFS和總生存期(overall survival, OS)具有相關性[16]。作為預測新輔助化療療效指標，PCR有助于預測TNBC和HER2BC患者預后，但有研究指出其不作為預測HRBC的生存指標，同時，在對治療反應的預測中，TILs也僅能預測TNBC和HER2BC對新輔助化療的反應[17]。Laas等[18]研究發現，將TILs評估聯合RCB評分可有效提高RCB評估系統的預測效能。

本實驗將RCB和TILs結合，分析RCB-TILs在乳腺癌新輔助化療中的預后作用及臨床意義。有研究顯示RCB-TILs是新輔助化療后所有浸潤型乳腺癌復發的重要預測因子，可能成為代表新輔助化療療效的有效指標，且RCB-TILs陽性TNBC患者占比更多，HRBC患者占比更少，與RCB-TILs陰性患者相比，陽性患者更易獲得PCR[19]，這與本實驗結果保持一致。本實驗Cox多因素分析顯示，RCB-TILs陽性是行新輔助化療患者的有利因素，Kaplan-Meier分析顯示RCB-TILs陽性患者的DFS更長。Pinard等[20]的研究結果亦證實RCB指數和CD4+TILs的組合有助于改善新輔助化療后TNBC患者預后的預測能力。TNBC殘余疾病中TILs的水平與新輔助化療后乳腺癌患者RFS和OS改善明顯相關，并且為RCB指數增加了進一步的預后信息[21]。且RCB-TILs受試者工作特征曲線分析表明，RCB-TILs對所有乳腺癌患者預后的預測能力均優于TILs和RCB，RCB-TILs陽性有助于延長所有患者DFS，可能成為新輔助化療后乳腺癌復發的獨立預測因素[19]。除此之外，RCB-TILs陽性患者的腫塊更小、淋巴結轉移及脈管侵犯更少。

綜上，本實驗結合新輔助化療前TILs浸潤情況，RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌腫瘤直徑、淋巴結轉移、脈管侵犯等具有相關性，其可能成為新輔助化療后乳腺癌DFS的潛在生物學標志物，對臨床后續的診療及評估具有指導意義。