細胞蠟塊在漿膜腔積液性淋巴瘤診斷中的應用價值

梁儲財，邵少慰

20%～30%淋巴瘤患者可出現漿膜腔積液。漿膜腔積液是淋巴瘤較常見的并發癥，以胸腔積液最多見，其次是腹腔和心包腔積液[1]。漿膜腔積液性淋巴瘤的細胞學診斷及病理分型是細胞病理學的難題，如何通過對細胞形態學的觀察尋找提示淋巴瘤的線索，選擇相應的輔助技術進行診斷與鑒別診斷，是病理醫師經常遇見的問題。本文收集13例漿膜腔積液性淋巴瘤，對其細胞蠟塊切片行HE、免疫細胞化學染色，以及部分病例行染色體核型分析、基因重排檢測及流式細胞學檢查等，探討漿膜腔積液性淋巴瘤的臨床病理學特征、診斷、鑒別診斷及細胞蠟塊的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年8月～2019年8月肇慶市第二人民醫院存檔的13例漿膜腔積液性淋巴瘤，其中男性10例，女性3例，年齡36～85歲，中位年齡59歲。其中胸腔積液8例，腹腔積液4例，心包腔積液1例(表1)。

表1 13例漿膜腔積液性淋巴瘤的臨床病理學特征

1.2 方法

1.2.1細胞蠟塊切片 收集新鮮漿膜腔積液標本100～200 mL，標本靜置10 min，棄去上清液，取標本瓶底部約100 mL液體震蕩搖勻，倒入2支50 mL離心管，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將2管沉淀物移至另一支離心管中，分別加入幾滴麝香草酚蛋清液和10%中性福爾馬林10 mL并搖勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液后，剔出沉淀物用擦鏡紙包裹放進脫水盒，常規脫水、浸蠟，包埋、切片，HE染色，余細胞蠟塊用作后續免疫細胞化學染色、EBER原位雜交、免疫球蛋白基因重排及染色體核型分析等檢測。

1.2.2免疫細胞化學染色及EBER原位雜交 免疫細胞化學染色采用SP法，一抗CK、CD45、CD20、CD79a、CD3、CD5、Ki-67、PAX5、MUM-1、CD10、TDT、BCL-2、BCL-6、CD99、CD23、CD30、CD138、Cyclin D1、MPO等，均購自廣州安必平公司，EBER原位雜交試劑購自北京中杉金橋公司。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，并設陰、陽性對照。

1.2.3分子遺傳學檢測 13例標本中有10例進行了分子檢測，其中6例送廣州安必平公司行細胞蠟塊切片染色體核型分析；其余4例送廣州金域檢驗中心，1例行細胞蠟塊切片免疫球蛋白基因重排，3例行外周血流式細胞學檢查。

1.3 結果判斷所有病例的細胞學涂片及細胞蠟塊切片均由2位高年資病理醫師閱片，依據鏡下不成熟淋巴細胞或淋巴樣細胞是否占優勢，作出淋巴細胞良、惡性的初步評價和分類(如大/小細胞性)，隨后參照是否已有活檢組織學確診，選取相應抗體和EBER原位雜交進行標記，協助進行淋巴瘤亞型分類。

2 結果

2.1 細胞學診斷與組織學診斷的符合度13例漿膜腔積液性淋巴瘤免疫細胞化學染色均符合非霍奇金淋巴瘤，其中12例為彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)，1例為T淋巴母細胞淋巴瘤(T lymphoblastic lymphoma, TLBL)。13例均有對應的組織學診斷結果，其中10例取頸部/腋窩淋巴結活檢，7例為DLBCL生發中心型(germinal center type, GCB)，3例為DLBCL非生發中心型(non-germinal central type, non-GCB)；小腸占位及胸膜病變各1例，活檢組織學診斷均為DLBCL,GCB型；縱隔包塊1例，活檢組織學診斷為TLBL。本組13例漿膜腔積液性淋巴瘤細胞學診斷與組織學診斷結果基本一致(表1)。

2.2 病理特征及免疫表型12例DLBCL漿膜腔積液細胞蠟塊切片：鏡下均見中等偏大的淋巴樣細胞彌漫分布，核圓形或卵圓形，染色質粗糙，可見1個或多個核仁，核分裂象易見(圖1)。免疫表型：CD45、CD79a、CD20(圖2)均彌漫陽性，Ki-67增殖指數平均值為75%，TDT、CD99、BCL-2、CD3、CD5、CK及EBER原位雜交均陰性，同時行CD10(圖3)、BCL-6和MUM-1染色，提示9例為GCB型，3例為non-GCB型。1例TLBL漿膜腔積液細胞蠟塊切片：鏡下可見體積增大的淋巴樣細胞，核染色質粉塵狀，核圓形，見小核仁，胞質少，凋亡小體易見(圖4)。免疫表型：CD3(圖5)、CD5、CD99和TDT(圖6)均陽性，Ki-67增殖指數為70%，CD20、PAX5、CD45、CD79a、CK陰性(表2)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表2 13例漿膜腔積液性淋巴瘤細胞蠟塊免疫細胞化學、EBER原位雜交及分子檢查結果

2.3 分子檢測13例中有10例行分子檢測，其中2例細胞蠟塊染色體核型檢測見3、7、17號染色體擴增(圖7)，p16基因缺失(圖8)，4例細胞蠟塊染色體核型檢測陰性，1例細胞蠟塊免疫球蛋白基因重排(+)；2例外周血流式細胞學見異常B腫瘤細胞，1例外周血流式細胞學符合急性T淋巴細胞白血病/TLBL(表2)。

3 討論

漿膜腔積液是淋巴瘤(淋巴細胞性白血病)常見而兇險的并發癥，其發生機制主要是由腫瘤細胞轉移或侵犯漿膜、阻塞胸導管，淋巴液引流受阻，或繼發感染所致[2]。漿膜腔積液性淋巴瘤以非霍奇金淋巴瘤多見，早期CT及胸部X線檢查均不易發現[3-4]。陳曉華等[5]報道，漿膜腔積液性淋巴瘤B細胞起源比T細胞起源更常見，其中B細胞淋巴瘤以DLBCL為主。本組13例漿膜腔積液性淋巴瘤包括12例DLBCL和1例TLBL，以B細胞起源為主，與文獻報道相符。

3.1 診斷淋巴瘤的早期癥狀多表現為頸部、腋窩、腹股溝等部位進行性、無痛性淋巴結腫大，部分還伴有發熱、消瘦、瘙癢、盜汗等全身表現，晚期還會出現腫瘤侵犯不同組織器官的相應臨床癥狀。漿膜腔積液則是淋巴瘤病變發展過程中一種兇險的伴隨癥狀，預后差。本組13例中，10例首發癥狀是淺表淋巴結腫大，1例發現小腸占位，1例發現縱隔占位，1例出現胸膜病變。13例患者除2例拒絕治療和1例失訪，其余10例均進行化療并獲得隨訪，僅2例分別隨訪22個月及18個月仍存活，其余患者均在數月內死亡。

淋巴瘤性漿膜腔積液多呈血性、黃色渾濁狀或乳糜樣。鏡下可見不成熟淋巴樣細胞，其成分單一，細胞黏附性差，無明顯成團、成簇現象，細胞胞質少，核質比高，呈裸核狀。核類圓形或不規則，染色質呈顆粒狀，易見核分裂象、核碎裂及凋亡小體[6]。因此，在漿膜腔積液細胞學鏡檢中出現上述形態學特征的，要高度考慮淋巴瘤的可能性[7-10]。對于組織學診斷在細胞學診斷之前，細胞學診斷可參照組織學診斷，只要合理選取免疫抗體進行檢測驗證即可明確診斷。而對于細胞學檢查時尚未有明確組織學診斷支持，則需行免疫細胞化學分步檢測，甚至要借助分子遺傳學檢測手段來輔助進行細胞學診斷及分型。本組13例中有5例組織學診斷在細胞學診斷之后，故需應用細胞蠟塊切片免疫細胞化學分步檢測協助診斷及分型。

部分漿膜腔積液性淋巴瘤僅依靠細胞形態學及免疫表型仍難以明確診斷及分型，而分子遺傳學診斷技術具有特異性高、準確率高、步驟簡便、快速等優勢，在淋巴瘤中應用越來越廣泛。許多淋巴瘤細胞有克隆性基因重排及染色體異常改變，常見的相關基因有IgH基因重排、t(1；14)易位、原癌基因TP53、BCL-2、MYC突變、API2-MALT1融合基因、NPM/ALK融合基因、6q缺失、染色體數目畸變等，因此可通過上述分子診斷技術對漿膜腔積液性淋巴瘤進行輔助診斷及分型[11]。本組13例中7例因未及時取得病理活檢或穿刺活檢中腫瘤細胞量少難以滿足分子檢測要求，故選取了腫瘤細胞豐富的細胞蠟塊作為分子檢材，其中6例行染色體核型分析，2例呈陽性，4例呈陰性，陽性率為33.3%；1例行免疫球蛋白基因重排呈陽性。

用漿膜腔積液制作細胞蠟塊，能收集到比傳統細胞涂片更豐富的細胞量，切片的細胞形態更清晰，能保留一定的組織結構，背景干凈，更利于鏡下觀察；更重要的是，細胞蠟塊可以多次切取，以便進行免疫細胞化學染色等后續檢查，可更好地幫助判斷腫瘤的組織起源和病理學亞型[11-12]。

3.2 鑒別診斷(1)淋巴細胞反應性增生：如結核病等慢性疾病或病毒感染等患者漿膜腔積液中可出現大量小淋巴細胞，其形態較一致，易與小細胞型淋巴瘤混淆；但這些小淋巴細胞表現成熟且明顯夾雜有其它炎癥細胞，TDT和B淋巴細胞標記均呈陰性，行基因重排提示淋巴細胞為多克隆性。(2)轉移性低分化或未分化癌：其癌細胞核質比高，核大小不一、深染，部分核偏位，呈印戒狀，細胞體積多為成熟淋巴細胞的2倍及以上，易與大細胞型淋巴瘤混淆；但此類癌細胞多成團成簇脫落，其異型性程度比淋巴瘤細胞更高，免疫細胞化學染色CK陽性，CD45陰性。(3)小圓細胞惡性腫瘤：如神經母細胞瘤、原始神經外胚層腫瘤(primitive neuroectodermal tumor, PNET)/尤因肉瘤、肺小細胞癌等。該類腫瘤影像學往往提示相應部位占位或包塊，也可引起漿膜腔積液，鏡檢見異形性細胞密集排列，細胞核深染，核質比高，核染色質均勻，核仁不明顯，部分可形成菊形團等特殊結構[13]，故需與淋巴瘤細胞出現的假菊形團結構鑒別，免疫細胞化學染色CD45均陰性，CD56、Syn和CgA陽性。

綜上，應用細胞蠟塊結合免疫細胞化學染色，以及染色體核型分析、基因重排檢測等分子遺傳學技術，對漿膜腔積液性淋巴瘤進行診斷及病理分型，不僅能為腫瘤精準治療提供依據，而且對評價治療效果及判斷預后也具有一定的臨床應用價值，尤其是當患者無法獲得滿意的組織病理活檢標本時更為重要。